半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)將目標(biāo)抗體的輕鏈205位纈氨酸（V）改造為半胱氨酸（C），并通過(guò)此改造后的半胱氨酸的游離巰基（?SH）與偶聯(lián)了小分子高活性細(xì)胞毒素（Payload）的mc?vc?PAB?OH連接子進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，形成均一性優(yōu)良的半胱氨酸改造的抗體?毒素偶聯(lián)物，其毒素比抗體比例（DAR）為1.6?2.0。此抗體?毒素偶聯(lián)物具有通式：2C1?LC?V205C?mc?vc?PAB?payload。同時(shí)，本發(fā)明專利技術(shù)還披露了此TDC藥物的制備、純化方法，對(duì)表達(dá)EGFRvIII及過(guò)表達(dá)EGFRwt腫瘤的治療應(yīng)用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種化合物及其制備方法和用途，特別涉及一類半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)及其制備方法和用途。
技術(shù)介紹
：表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(EpidermalGrowthFactorReceptor)是一種糖蛋白，屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB-4)。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，貫通細(xì)胞膜，分子量170KDa，靠與配體結(jié)合來(lái)激活。激活后，EGFR由單體轉(zhuǎn)化為二聚體。EGFR還可能和ErbB受體家族的其他成員聚合來(lái)激活，例如ErbB2/Her2/neu。EGFR通常低量表達(dá)于多種正常組織細(xì)胞，包括皮膚、肝臟等，與正常生理作用相關(guān)。EGFR過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)，包括頭頸癌、膀胱癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalayetal.,2003；HerbstandShin,2002)。多種腫瘤在過(guò)量表達(dá)野生型EGFR(EGFRwt)的同時(shí)也表達(dá)突變型的EGFR，EGRFvIII(de2-7EGFR)。EGRFvIII是EGFRwt第6-273氨基酸缺失的EGFR突變型(Sugawaetal.,1990)，介導(dǎo)配體非依賴型的細(xì)胞持續(xù)活化。EGRFvIII被報(bào)道于多種腫瘤中，包括腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrandetal.,1997；OlapadeOlaopaetal.,2000)。EGRFvIII的出現(xiàn)往往預(yù)示腫瘤預(yù)后不良。EGRFvIII特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞組織中，正常組織細(xì)胞不表達(dá)EGRFvIII，這為靶向治療提供了良好的靶點(diǎn)。抗體-毒素偶聯(lián)物(Antibodydrugconjugate,ADC)是靶向治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域，已在美國(guó)獲批上市的兩個(gè)藥物Adcetris和Kadcyla表現(xiàn)出良好的臨床療效，并且有超過(guò)50個(gè)ADC藥物在進(jìn)行臨床階段研究。以EGFRvIII為靶點(diǎn)的通過(guò)鏈間二硫鍵巰基非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC藥物ABT-414已在美國(guó)進(jìn)行臨床II期試驗(yàn)，體現(xiàn)出一定的臨床效果，但由于其采用非定點(diǎn)偶聯(lián)方式，其藥物均一性差，對(duì)病人造成較嚴(yán)重的毒副作用，限制了其臨床用藥量，直接影響了其臨床治療效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
：本專利技術(shù)的化合物半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)具有通式：2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。其中2C1是親本抗體2A1輕鏈205位纈氨酸(V)改造為半胱氨酸(C)后的抗體。2C1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:1，2C1的輕鏈氨基酸序列為SEQIDNO:12。2C1的親本抗體2A1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:1，2A1的輕鏈氨基酸序列為SEQIDNO:14。2C1保持了其親本抗體2A1與抗原結(jié)合的能力(親和力)，抗原為人的野生型表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRwt)及人的突變型表皮生長(zhǎng)因子受體(de2-7EGFR/EGRFvIII)。2C1通過(guò)其輕鏈205位改造的半胱氨酸巰基與mc-vc-PAB-payload進(jìn)行抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)定點(diǎn)偶聯(lián)，毒素比抗體比例DAR為1.6-2.0。本專利技術(shù)的化合物半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)藥物主要用于治療表達(dá)EGFRvIII及過(guò)表達(dá)EGFRwt的腫瘤，包括腦膠質(zhì)癌、非小細(xì)胞肺癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等。本專利技術(shù)記載的全新半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物(TDC)相較非定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC具有藥物均一性好，副作用小等優(yōu)點(diǎn)，臨床前研究結(jié)果顯示其顯著優(yōu)于非定點(diǎn)偶聯(lián)ADC。附圖說(shuō)明圖1為HIC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDCDAR；圖2A為SEC-HPLC檢測(cè)2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC聚集情況；圖2B為SEC-HPLC檢測(cè)通過(guò)抗體天然鏈間二硫鍵進(jìn)行半胱氨酸非定點(diǎn)偶聯(lián)的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC樣品；圖3A為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC與2C1保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力；圖3B為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC、2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOXTDC保持了2A1與抗原EGFRvIII的親和力；圖4A為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC對(duì)EGFRwt過(guò)表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4B為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAFADC、對(duì)EGFRwt過(guò)表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4C為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-PBDADC對(duì)EGFRwt過(guò)表達(dá)的人皮膚鱗癌細(xì)胞A431的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4D為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAETDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAEADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4E為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAFTDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-MMAFADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4F為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBDTDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-PBDADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4G為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38TDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖4H為2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-DoxTDC及其對(duì)應(yīng)的2A1-mc-vc-PAB-DoxADC對(duì)表達(dá)EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50檢測(cè)結(jié)果；圖5A為荷瘤小鼠藥效檢測(cè)1mg/kg劑量進(jìn)行單次靜脈給藥結(jié)果；圖5B為荷瘤小鼠藥效檢測(cè)6mg/kg劑量給藥結(jié)果；圖6A為大鼠毒性檢測(cè)嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；圖6B為大鼠毒性檢測(cè)AST檢測(cè)結(jié)果；圖6C為大鼠毒性檢測(cè)每天監(jiān)測(cè)體重變化情況。實(shí)施例1mc的合成于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的馬來(lái)酸酐3.5g(0.036mol)。反應(yīng)液于120℃攪拌反應(yīng)4～6h。反應(yīng)完畢后，停止加熱，自然冷卻到室溫。60℃減壓濃縮除去大部分醋酸。所得棕黃色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有機(jī)層。有機(jī)層依次用水、飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得到棕黃色油狀本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
半胱氨酸改造的抗體?毒素偶聯(lián)物，具有如下通式：2C1?LC?V205C?mc?vc?PAB?payload。

【技術(shù)特征摘要】
1.半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，具有如下通式：2C1-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。2.權(quán)利要求1所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在于：其中2C1是目標(biāo)抗體輕鏈205位纈氨酸（V）改造為半胱氨酸（C）后的抗體，2C1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:1，輕鏈氨基酸序列為SEQIDNO:12。3.權(quán)利要求2所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在于：包含一個(gè)成熟的重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列至少有95%與SEQIDNO:1相同。4.權(quán)利要求2所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在于：包含一個(gè)成熟的輕鏈，其氨基酸序列至少有95%與SEQIDNO:12相同。5.權(quán)利要求1所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在于：其中mc-vc-PAB-OH連接子為：。6.權(quán)利要求1所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在于：其中Payload為小分子高活性細(xì)胞毒素，包括但不限于MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox；MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式分別為：。7.權(quán)利要求1所述的半胱氨酸改造的抗體-毒素偶聯(lián)物，其特征在...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱義，王一茜，卓識(shí)，李杰，陳瀾，余永國(guó)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：四川;51