一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法技術

本發明專利技術涉及一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法；利用金納米棒和癌胚抗原標記抗體以及辣根過氧化物酶的靜電吸附作用，制備多酶標記的金納米粒子甲胎蛋白免疫探針，對癌胚抗原(carcino?embryonic?antigen?CEA)，這種廣泛存在于內胚葉起源的消化系統癌的蛋白標志物進行定性定量的檢測，建立蛋白標志物檢測的新方法，提高檢測的靈敏度和特異性。本發明專利技術的特點在于：整個制備過程簡單，適合于產業化生產；可定性定量檢測癌胚抗原，且特異性良好；整個檢測過程，成本低廉且操作非常簡便，適合高危人群的社區腫瘤篩選，建立了一種腫瘤檢測的新方法。

Method for preparing gold nanorods conjugated horseradish peroxidase and carcinoembryonic antigen antibody

The invention relates to a preparation method of a gold nanorods coupling horseradish peroxidase labeled antibody and carcinoembryonic antigen; the use of gold nanorods and carcinoembryonic antigen labeled antibody and horseradish peroxidase on the electrostatic adsorption of gold nanoparticles, AFP immuno probe preparation of enzyme labeled, of carcinoembryonic antigen (carcino embryonic antigen CEA), the detection of gastrointestinal cancer biomarkers that widely exist in the endoblast origin of qualitative and quantitative, to establish a new method for detection of protein markers, enhancing detection sensitivity and specificity. The invention is characterized in that the preparation process is simple and suitable for industrial production; can be qualitative and quantitative detection of carcinoembryonic antigen, and the specificity is good; the whole detection process, low cost and convenient operation, suitable for the screening of high-risk tumors, established a new method for tumor detection.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及納米材料制備
，更具體的是涉及一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法。
技術介紹
酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可導致大量的催化過程，免疫酶技術就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。酶與抗體或抗原結合后，既不改變抗體成抗原的免疫學反應的特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使基質水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變為有色的氧化型。呈色反應顯示了酶的存在，從而證明發生了相應的免疫反應。這是一種特異而敏感的技術，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位。酶聯免疫吸附試驗兼有熒光標記和放射免疫試驗的優點，由于酶標記結合物具有制備容易、穩定、有效期長、敏感性高等優點，同時可以直接用肉眼觀察或光學顯微鏡觀察，所得結果因而客觀可靠。辣根過氧化物酶是一種臨床檢驗試劑中一種最常用的酶之一，廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類(ELISA)試劑盒的顯色反應。血清蛋白標志物檢測腫瘤已經越來越引起人們的關注，蛋白標志物檢測腫瘤簡便無創，檢測結果直觀且可以定量，可以動態監測腫瘤患者，在臨床上具有很高的應用價值。蛋白標志物可以是在惡性腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞的基因表達而合成分泌的，存在于細胞、組織或體液中，能夠用一定方法來定量且能證實腫瘤存在的物質。癌胚抗原CEA是大腸癌組織產生的一種糖蛋白，可廣泛存在于內胚葉起源的消化系統癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發展、監測和預后估計是一個較好的腫瘤標志物，但其特異性不強，靈敏度不高，對腫瘤早期診斷作用不明顯。金納米棒是一種棒狀金納米顆粒，有豐富的表面積，在體外診斷領域常用于標記抗體和酶分子等。所以本文擬研制一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法，用于檢測癌胚抗原腫瘤標志物。
技術實現思路
鑒于蛋白標志物在腫瘤檢測中的重要地位、HRP檢測獨特的顯色性質以及酶聯免疫檢測技術的優勢。我們將利用金納米棒和癌胚抗原標記抗體以及辣根過氧化物酶的靜電吸附作用，制備多酶標記的金納米粒子甲胎蛋白免疫探針，對癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)，這種廣泛存在于內胚葉起源的消化系統癌的蛋白標志物進行定性定量的檢測，建立蛋白標志物檢測的新方法，提高檢測的靈敏度和特異性。本專利技術的技術方案如下：一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法；其步驟如下：(1)將摩爾質量配比為氯金酸和十六烷基三甲基溴化銨加入到反應器，加入硼氫化鈉得到金種溶液；(2)取上述金種溶液加入到反應器，加入氯金酸、十六烷基三甲基溴化銨、抗壞血酸和硝酸銀混合液，制備得到金納米棒(AuNRs)；(3)將金納米棒加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節金納米棒pH為9.0～9.5，將癌胚抗原CEA標記抗體(Ab1)和辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米棒混合，所得AuNRs、HRP和Ab1混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；(4)將牛血清白蛋白加入上述AuNRs、HRP和Ab1混合液封閉，最后得到multi-HRP-AuNRs-Ab1檢測探針。所述氯金酸是四水合氯金酸。所述氯金酸和十六烷基三甲基溴化銨摩爾配比為1:400～500；氯金酸和硼氫化鈉摩爾配比為1:1～3。所述步驟2)中氯金酸：硝酸銀：十六烷基三甲基溴化銨：抗壞血酸的摩爾比為＝1:400:2:40～240。所述CEA標記抗體(Ab1)：辣根過氧化物酶(HRP)質量配比為1:1～9；金納米棒AuNRs：(HRP和Ab1)混合液質量配比為100～500:1。所述AuNRs：牛血清白蛋白的質量配比為5～10:1。如圖3所示，一個金納米棒分子上面可以同時偶聯多個HRP分子和癌胚抗原標記抗體分子，有效提高了酶分子和抗體分子的偶聯效率；如圖1所示本專利技術制備的金納棒等離子體帶在700～1250nm之間；如圖2所示金納米粒子偶聯辣根過氧化物酶和甲胎蛋白標記抗體后粒徑增加60nm左右，表明辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體已經成功標記到金納米棒上。如圖4所示，以CEA抗原濃度為橫坐標，抑制率Inhibition(％)作為縱坐標，擬合出一條曲線：R2＝0.9966y＝-4E-07x2+0.0014x+0.2783，可知multi-HRP-AuNRs-Ab1檢測探針為多酶標記探針可有效提高檢測靈敏度。本專利技術制備的金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體優勢在于：1.采用種子生長法制備金納米棒，硼氫化鈉、抗壞血酸、十六烷基溴化銨以及硝酸銀的存在有利于制備尺寸均一的金納米棒。2.采用金納米棒同時標記酶和抗體，在實現多酶多抗體標記的基礎上將大大提高檢測的靈敏度，簡便有效。3.采用堿性條件下金納米棒與甲胎蛋白標記抗體Ab1和辣根過氧化物酶(HRP)的靜電吸附相互作用得到檢測探針，徹底解決了傳統酶標抗體步驟繁瑣的問題。附圖說明圖1本專利技術制備的金納米棒的電子透射電鏡照片，等離子體帶700nm(a)；760nm(b)；790nm(c)；880nm(d)；1130nm(e)；1250nm(f)。圖2本專利技術制備的金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體粒度數據。圖3本專利技術制備的金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體圖。圖4本專利技術制備的金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體免疫實驗標準曲線。具體實施方式下面的實施案例中將對本專利技術作進一步的闡述，但本專利技術不限于此。實施案例1：(1)將2.5μmol摩爾質量配比為氯金酸(HAuCl4)和1000μmol十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide CTAB)加入到反應器，加入6μmol硼氫化鈉(NaBH4)得到金種溶液；(2)取上述金種溶液加入到反應器，加入摩爾質量配比為氯金酸：十六烷基三甲基溴化銨：抗壞血酸：硝酸銀＝1:400:2:40，制備得到金納米棒；(3)將5mg金納米棒(AuNRs)加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節金納米棒pH為9.0，將0.01mg癌胚抗原CEA標記抗體(Ab1)和0.04mg辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米棒混合，所得AuNRs、HRP和Ab1混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；(4)將1mg牛血清白蛋白加入上述AuNRs、HRP和Ab1混合液封閉，最后得到multi-HRP-AuNRs-Ab1檢測探針。以濃度為0ng/mL、30ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL CEA抗原完成免疫實驗。如圖1(a)所示，所得金納米棒等離子體帶在700nm處。如圖4所示，以CEA抗原濃度為橫坐標，抑制率Inhibition(％)作為縱坐標，擬合出一條曲線：R2＝0.9966y＝-4E-07x2+0.0014x+0.2783實施案例2：(1)將2.5μmol摩爾質量配比為氯金酸(HAuCl4)和1000μmol十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammoni本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法；其特征是步驟如下：(1)將摩爾質量配比為氯金酸和十六烷基三甲基溴化銨加入到反應器，加入硼氫化鈉得到金種溶液；(2)取上述金種溶液加入到反應器，加入氯金酸、十六烷基三甲基溴化銨、抗壞血酸和硝酸銀混合液，制備得到金納米棒(AuNRs)；(3)將金納米棒加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節金納米棒pH為9.0～9.5，將癌胚抗原CEA標記抗體(Ab1)和辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米棒混合，所得AuNRs、HRP和Ab1混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；(4)將牛血清白蛋白加入上述AuNRs、HRP和Ab1混合液封閉，最后得到multi?HRP?AuNRs?Ab1檢測探針。

【技術特征摘要】
1.一種金納米棒偶聯辣根過氧化物酶和癌胚抗原標記抗體的制備方法；其特征是步驟如下：(1)將摩爾質量配比為氯金酸和十六烷基三甲基溴化銨加入到反應器，加入硼氫化鈉得到金種溶液；(2)取上述金種溶液加入到反應器，加入氯金酸、十六烷基三甲基溴化銨、抗壞血酸和硝酸銀混合液，制備得到金納米棒(AuNRs)；(3)將金納米棒加入反應器，通過碳酸鉀水溶液調節金納米棒pH為9.0～9.5，將癌胚抗原CEA標記抗體(Ab1)和辣根過氧化物酶(HRP)混合液與金納米棒混合，所得AuNRs、HRP和Ab1混合液在旋轉混合架上旋轉混勻后靜置處理；(4)將牛血清白蛋白加入上述AuNRs、HRP和Ab1混合液封閉，最后得到multi-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：常津，武玉東，宮曉群，
申請(專利權)人：天津大學，
類型：發明
國別省市：天津;12