電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片及制備方法技術

本發明專利技術公開了一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片及制備方法，由PDMS蓋片(1)與具有蓋片形狀和大小相適應的基片(2)鍵合而成，基片(2)上至少設置有一對微小電極(8)，蓋片上有微流控管道，基片(2)上設置有微小電極的一面和與之形成接觸的蓋片上的微流控管道接觸面對準鍵合，實現對微流控管道的封閉；微流控管道由進樣口(4)、一根主管道(7)和出樣口(3)組成，主管道(7)具有樣品導入管道(10)、收縮檢測管道(11)和最狹窄部位(5)。本發明專利技術避免了使用鞘流聚焦技術所必需的復雜管道和流體控制系統，優化的結構尺寸參數減小了管道尺寸縮小造成的流阻增大效應，同時又提高了檢測的通量和靈敏度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物細胞檢測
，特別是涉及一種用于微小顆粒/生物細胞檢測的微流控芯片的結構設計。
技術介紹
傳統的庫爾特計數器采用直流電信號對溶液中通過微孔的小顆粒進行檢測，并發展為血細胞分析的儀器。另一種對微小顆粒/細胞進行檢測的設備是流式細胞儀。流式細胞儀采用的是光學檢測方式對顆粒進行檢測，通常需要對被檢顆粒進行熒光標記，而非標記的檢測方法避免了對被測物的干擾和傷害，例如電阻抗檢測就是非標記檢測的一種。電阻抗檢測與庫爾特計數的方法差異主要是電阻抗檢測采用了交流電激勵信號而不是直流電信號。微流控電阻抗流式檢測芯片就是將電阻抗的非標記檢測與流式檢測中控制流體中顆粒/細胞逐個有序通過檢測部位的技術結合，在微流控芯片上實現小型化、集成化?，F有對微小顆粒/細胞流式檢測的微流控芯片通常是采用鞘流約束顆粒位置或者管道收縮來實現足夠的檢測靈敏度。鞘流聚焦約束顆粒位置的方案在傳統流式細胞儀上廣泛使用，在微流控芯片上也有人采用，如中國專利201210482142.7。但是鞘流技術增加了芯片的復雜性，對流體控制也增加了難度。中國專利201310283051.5就提出了一種無鞘流的微流控芯片上流式檢測方案。在文獻報道的微流控電阻抗流式檢測芯片的管道收縮的方案中，通常是用一條較長的收縮管道(約5D～20D，D為細胞直徑)來實現，電極位于收縮管道內部，或者遠離收縮管道以較高的激勵電壓實現檢測。這樣的管道缺點在于，由于管道較長，流阻較大，要么管道較寬適當降低流阻，但犧牲了檢測靈敏度，增加了多個顆粒/細胞在檢測區域的可能性；要么縮窄管道，讓管道寬度等于甚至小于顆粒/細胞外徑以提高檢測靈敏度，但流阻太大，檢測通量很低，也容易堵塞管道。而電極如果遠離檢測部位，雖然可以通過提高激勵電壓來提高檢測靈敏度，但是較高的電壓有可能造成對細胞等被測顆粒的損害。本專利技術采用電阻抗檢測方式實現微流控芯片上的流式檢測，檢測方法是非標記的，對細胞或微粒的狀態沒有影響，芯片結構和流體操作簡單，同時能夠滿足較高的通量和檢測靈敏度，是現有的技術形式的有益補充。
技術實現思路
為了克服上述現有技術中存在的缺陷，本專利技術提出了一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片及制備方法，通過縮短最窄的檢測管道的長度，從而大大減小了流阻的增大效應，同時又提高了檢測的靈敏度。本專利技術的一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，所述微流控芯片的結構由蓋片1和與具有蓋片形狀和大小相適應的基片2鍵合而成，蓋片1位于基片2中央，基片2的邊緣部分暴露在外，基片2上通過微電子加工有不少于兩個微小電極8，蓋片上有微小的翻模出來的微流控管道，基片2上設置有微小電極的一面和蓋片上含微流控管道的接觸面對準鍵合，實現對微流控管道的封閉，同時使微小電極8位于微流控管道底面；微流控管道由進樣口4、一根直的主管道7、出樣口3和組成，主管道7沿進樣口到出樣口中心的連線延伸，在連線兩邊呈對稱的結構，從進樣口到最狹窄檢測部位5的中間段通過兩處收縮部位12區分為樣品導入管道10、用以引導被測顆粒/細胞在主管道7中央流動的收縮檢測管道11和進一步收縮而形成的最狹窄部位5，所述最狹窄部位5位于所述微小電極8間隙的正中間，微小電極8在最狹窄部位5的兩邊對稱分布；對分散到溶液中的微粒/細胞進行檢測時，微粒/細胞能夠實現逐個依次通過最狹窄的檢測部位5，即流式檢測的效果。所述微小電極8的寬度為管道最狹窄部位寬度的0.1～5倍，高度通常為幾十納米到幾百納米之間，用于檢測電阻抗信號，通過識別阻抗信號上的脈沖對被測溶液中的微粒/細胞9進行計數、分析，微小電極8在管道最狹窄處暴露于管道溶液中，方向與管道方向垂直；電極暴露于管道溶液的部分是其工作區域，通過微電子加工的引線14把所述工作區域微米級寬度的微小電極連接到芯片邊緣的焊盤13，從而可與檢測電路相連。所述主管道最狹窄部位5的容積是被測顆粒/細胞體積的1～10倍，收縮檢測管道11的寬度是最狹窄部位5的1.5～3倍，通過兩處收縮部位12，管道寬度從進樣口到最狹窄的檢測部位5逐漸收窄。根據被測溶液中的微粒/細胞9的彈性，所述主管道7的長寬高尺寸設置為被測溶液中的微粒/細胞9直徑的0.3～5倍，對于彈性大的被測溶液中的微粒/細胞9，尺寸適用小于1倍直徑，對于彈性小的被測溶液中的微粒/細胞9，尺寸必須大于1倍直徑。所述蓋片1的進樣口4與主管道7之間的位置設置有過濾微柱6，微柱之間構成網狀管道，管道寬度和高度一般和最狹窄部位長寬高尺寸中的最小值一致，防止大的顆粒進入管道造成最狹窄處的堵塞。本專利技術的電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片及制備方法，該方法包括：蓋片1加工工藝流程、基片2加工工藝流程以及蓋片和基片的鍵合工藝流程，其中：帶有微流控管道的PDMS蓋片加工工藝流程包括以下步驟：a.根據微流控管道結構設計的圖案加工出掩模版；b.提供拋光平整的硅片或玻璃片基底，清洗干凈；c.在拋光的基底上通過甩膠工藝均勻涂敷一層SU－8光刻膠，厚度即為所需要的管道的高度；d.在光刻機使用掩模版，利用紫外光對SU－8光刻膠層進行曝光；e.對曝光后的光刻膠進行顯影，去除多余光刻膠，留下管道結構陽模具；f.利用加工出來的SU－8陽模具，將其四周用鋁箔紙圍起來構成用于澆筑翻模的模具；g.將PDMS預聚物和固化劑以10:1的比例混合均勻，抽真空后倒入澆筑模具，并在80度烘箱烘烤70分鐘固化PDMS；h.將固化的PDMS從模具剝離，得到帶有微流控管道的PDMS蓋片；i.使用打孔器加工出進樣口和出樣口與微流控管道相連，備用。帶有電極的基片加工工藝流程包括以下步驟：a.根據電極及其引線圖案設計加工出掩模版；b.將拋光平整的硅片或玻璃片清洗干凈；c.在拋光的基底上通過甩膠工藝均勻涂敷一層光刻膠；d.在光刻機使用掩模版，利用紫外光對光刻膠層進行曝光；e.對曝光后的光刻膠進行顯影，去除多余光刻膠，留下具有電極及其引線圖案結構模具；f.使用磁控濺射工藝先后在光刻后的基片上依次濺射厚度為10～100納米的鈦以及厚度為10～400納米的金或鉑；g.使用丙酮去掉光刻膠以及光刻膠上面的金屬層，形成金或鉑電極圖案，從而加工出一面帶有電極(8)、引線(14)和焊盤(13)的基片；帶有微流控管道的蓋片和帶電極的基片的高精度對準、不可逆鍵合加工工藝流程包括以下步驟：a.將蓋片1和基片2都清洗干凈并吹干；b.根據蓋片面積準備一滴溶劑；c.用表面等離子體清洗機對蓋片和基片進行處理約10～100秒；d.將溶劑滴加到有電極的一面朝上放置的基片上，涂勻，再將蓋片有微流控管道的一面朝下放置在基片上，讓溶劑保護蓋片和基片的接觸面，避免直接接觸導致基片與蓋片快速鍵合；e.在顯微鏡下觀察并調整蓋片在基片上的位置，使管道和電極的位置實現精確對準，其中管道的最狹窄部位處于一對微電極間隙的中央，電極在其兩端對稱分布，電極暴露到管道中且與管道的兩個豎直的側壁均有接觸，電極長度方向與管道長度方向基本垂直，最終的誤差小于5微米；f.靜置1～30分鐘，讓溶劑蒸發，蓋片和基片初步鍵合，位置基本固定；g.將初步鍵合的芯片放置到50～80度烘箱烘烤30～60分鐘，實現牢固鍵合。本專利技術的一種PDMS微流控芯片的鍵合工藝方法，該方法包括以本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的結構由蓋片(1)和與具有蓋片形狀和大小相適應的基片(2)鍵合而成，蓋片(1)位于基片中央，基片(2)的邊緣部分暴露在外，基片(2)上通過微電子加工有不少于兩個微小電極(8)，蓋片上有微小的翻模出來的微流控管道，基片(2)上設置有微小電極的一面和蓋片上含微流控管道的接觸面對準鍵合，實現對微流控管道的封閉，同時使微小電極(8)位于微流控管道底面；微流控管道由進樣口(4)、一根直的主管道(7)和出樣口(3)組成，主管道(7)沿進樣口到出樣口中心的連線延伸，在連線兩邊呈對稱的結構，從進樣口到最狹窄檢測部位(5)的中間段通過兩處收縮部位(12)區分為樣品導入管道(10)、用以引導被測顆粒/細胞在管道中央流動的收縮檢測管道(11)和進一步收縮而形成的最狹窄部位(5)，所述最狹窄部位(5)位于所述微小電極(8)間隙的正中間，微小電極(8)在最狹窄部位(5)的兩邊對稱分布；對分散到溶液中的微粒/細胞進行檢測時，微粒/細胞能夠實現逐個依次通過最狹窄的檢測部位(5)，即流式檢測的效果。

【技術特征摘要】
1.一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的結構由蓋片(1)和與具有蓋片形狀和大小相適應的基片(2)鍵合而成，蓋片(1)位于基片中央，基片(2)的邊緣部分暴露在外，基片(2)上通過微電子加工有不少于兩個微小電極(8)，蓋片上有微小的翻模出來的微流控管道，基片(2)上設置有微小電極的一面和蓋片上含微流控管道的接觸面對準鍵合，實現對微流控管道的封閉，同時使微小電極(8)位于微流控管道底面；微流控管道由進樣口(4)、一根直的主管道(7)和出樣口(3)組成，主管道(7)沿進樣口到出樣口中心的連線延伸，在連線兩邊呈對稱的結構，從進樣口到最狹窄檢測部位(5)的中間段通過兩處收縮部位(12)區分為樣品導入管道(10)、用以引導被測顆粒/細胞在管道中央流動的收縮檢測管道(11)和進一步收縮而形成的最狹窄部位(5)，所述最狹窄部位(5)位于所述微小電極(8)間隙的正中間，微小電極(8)在最狹窄部位(5)的兩邊對稱分布；對分散到溶液中的微粒/細胞進行檢測時，微粒/細胞能夠實現逐個依次通過最狹窄的檢測部位(5)，即流式檢測的效果。2.如權利要求1所述的一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，所述微小電極(8)的寬度為管道最狹窄部位寬度的0.1～5倍，高度通常為幾十納米到幾百納米之間，用于檢測電阻抗信號，通過識別阻抗信號上的脈沖對被測溶液中的微粒/細胞(9)進行計數、分析，微小電極(8)在管道最狹窄處暴露于管道溶液中，方向與管道方向垂直；電極暴露于管道溶液的部分是其工作區域，通過微電子加工的引線(14)把所述工作區域微米級寬度的微小電極連接到芯片邊緣的焊盤(13)，從而可與檢測電路相連。3.如權利要求1所述的一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，所述主管道最狹窄部位(5)的容積是被測顆粒/細胞體積的1～10倍之間，收縮檢測管道(11)的寬度是最狹窄部位(5)的1.5～3倍，通過兩處收縮部位(12)，管道寬度從進樣口到最狹窄的檢測部位(5)逐漸收窄。4.如權利要求1所述的一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，根據被測溶液中的微粒/細胞(9)的彈性，所述主管道(7)的長寬高尺寸設置為被測溶液中的微粒/細胞(9)直徑的0.3～5倍，對于彈性大的被測溶液中的微粒/細胞(9)，尺寸適用小于1倍直徑，對于彈性小的被測溶液中的微粒/細胞(9)，尺寸必須大于1倍直徑。5.如權利要求1所述的一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片，其特征在于，所述蓋片(1)的進樣口(4)與主管道(7)之間的位置設置有過濾微柱(6)，微柱之間構成網狀管道，管道寬度和高度一般和最狹窄部位長寬高尺寸中的最小值一致，防止大的顆粒進入管道造成最狹窄處的堵塞。6.一種電阻抗流式檢測微小顆粒、細胞的微流控芯片的制備方法，其特征在于，該方法包括：蓋片(1)加工工藝流程、基片(2)加工工藝流程以及蓋片和基片的鍵合工藝流程，其中：帶有微流控管道的PDMS蓋片加工工藝流程包括以下步驟：a.根據微...

【專利技術屬性】
技術研發人員：謝新武，程振，徐友春，田豐，徐新喜，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生裝備研究所，清華大學，
類型：發明
國別省市：天津;12