與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合多肽配基設計及應用制造技術

本發明專利技術涉及與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合多肽配基設計及應用，屬于多肽設計及病毒抗原檢測領域。其中，所述的多肽配基序列為FYKRTSSS。本發明專利技術借助于分子對接及虛擬篩選技術，在黃病毒科病毒E2蛋白晶體結構的基礎上，通過分子對接技術，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結合模式與親和力最佳的多肽配體，最終得到可與豬瘟病毒E2蛋白結合的多肽配基，其多肽配基序列為FYKRTSSS，即Pep1。Pep1序列與人工表達的CSFV?E2蛋白之間相互作用的平衡解離常數KD為4.72×10?6M，即4.72μM，說明親和力較好。本發明專利技術設計而成的Pep1序列與人工接種CSFV、人工表達CSFV?E2蛋白均可以結合，除與BVDV?E2蛋白反應性較高外，與其它病毒蛋白均不發生交叉性反應，特異性較好。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合多肽配基設計及應用，屬于多肽設計及病毒抗原檢測領域。
技術介紹
基于分子對接的虛擬篩選技術是一種新興的研究多肽與蛋白質之間相互作用的技術手段。這一技術主要是運用計算機快速運算實現多肽與相應靶標蛋白在空間構象上的對接，將虛擬多肽數據庫中的分子逐一與靶標蛋白晶體結構的特定活性位點進行對接，通過計算機快速運算并不斷調整多肽與靶標蛋白結合的位置、構象、分子內部可旋轉鍵的二面角和靶標蛋白的氨基酸殘基側鏈和骨架，尋找多肽分子與靶標蛋白在空間結構上的最佳構象，并預測兩者之間的結合模式與親和力，通過評分值挑選出接近天然構象的與靶標蛋白親和力最佳的多肽配體的一種理論模擬分子間相互作用的方法。豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)是造成豬群爆發豬霍亂，我國也稱之為爛腸瘟的主要病原。它是以發病豬群出現高熱、出血灶和白細胞減少癥為主要特征的一種高發病率和死亡率的烈性傳染病。該病毒在全世界范圍內廣泛分布，給全球的養殖業帶來了極大的影響與損失。CSFV是黃病毒科，瘟病毒屬的成員之一，與牛病毒性腹瀉病毒(BovineViralDiarrheaVirus,BVDV)在結構上具有很高的相似性。CSFV屬于有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長約12.3kb，形成一個大的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)，編碼一個由3989個氨基酸組成的多聚蛋白。E2蛋白是一種典型的位于跨膜區的囊膜糖蛋白，在病毒吸附及侵入宿主細胞過程中發揮著至關重要的作用。同時，它作為CSFV的免疫優勢蛋白，可以誘導機體產生高滴度的中和抗體水平，從而使機體具備可抵抗強毒株感染的能力，是研制針對CSFV新型疫苗的首選靶蛋白，因此E2蛋白也成為許多科研工作者的主要研究對象。
技術實現思路
本專利技術借助于分子對接及虛擬篩選技術，在黃病毒科病毒E2蛋白晶體結構的基礎上，通過分子對接技術，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結合模式與親和力最佳的多肽配基，其多肽配基序列為FYKRTSSS，即Pep1。人工合成Pep1，利用表達純化的CSFVE2蛋白進行表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)與ELISA結合試驗，結果表明，人工合成的Pep1與CSFVE2蛋白有良好的結合能力，由此證明，借助本專利技術設計而成的多肽配基，可用于對豬瘟病毒抗原進行定量和定性的快速檢測。為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案是：與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合的多肽配基，所述的多肽配基序列為FYKRTSSS。所述的與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合的多肽配基，包括以所述的多肽配基序列為核心，任何對該多肽配基序列所進行的相應調整或修飾；修飾材料包括但不限制在納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定的蛋白質。將所述的多肽配基序列用于豬瘟病毒或者牛病毒性腹瀉病毒的E2蛋白的鑒定，其中包括但不局限于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。一種所述的多肽配基在豬瘟病毒或者牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的快速檢測中的應用。一種所述的多肽配基在對豬瘟病毒抗原進行定量和定性檢測中的應用。本專利技術的有益效果：1、本專利技術借助于分子對接及虛擬篩選技術，在黃病毒科病毒E2蛋白晶體結構的基礎上，通過分子對接技術，搜尋虛擬多肽庫中與靶標蛋白結合模式與親和力最佳的多肽配體，最終得到可與豬瘟病毒E2蛋白結合的多肽配基，其多肽配基序列為FYKRTSSS，即Pep1。人工合成Pep1，并與豬瘟病毒E2蛋白進行親和力鑒定，Pep1序列與人工表達的CSFVE2蛋白之間相互作用的平衡解離常數KD為4.72×10-6M，即4.72μM，說明親和力較好。2、由于豬瘟病毒純化技術的局限性，針對豬瘟病毒的抗體獲得很難，本專利技術設計得到的Pep1序列很好地避免了這一難題，實現快速人工合成與低廉檢測成本。3、本專利技術設計而成的Pep1序列與人工接種CSFV、人工表達CSFVE2蛋白均可以結合，除與BVDVE2蛋白反應性較高外，與其它病毒蛋白均不發生交叉性反應，特異性較好。4、本專利技術與傳統噬菌體多肽庫篩選相比，具有簡單，快速及成本低的特點；通過計算機輔助實施分子對接，可為實現豬瘟病毒E2蛋白結構功能解析提供較好的理論指導。5、本專利技術與人工表達純化的蛋白進行免疫來獲得針對蛋白抗體的過程相比，具有操作簡單，省時省力，費用低等優點；通過對篩選Pep1序列進行標記，可實現對豬瘟病毒E2蛋白進行定性和定量的快速檢測。附圖說明圖1為Pep1序列與CSFVE2蛋白的對接結果展示。圖2為Pep1序列與人工表達CSFVE2蛋白的SPR親和力鑒定結果。其中，縱坐標代表傳感器所檢測到的信號值；橫坐標代表樣品在傳感器中相互作用的時間。圖中，從上到下各曲線對應的Pep1溶液濃度逐漸降低。圖3為Pep1序列與人工表達CSFVE2蛋白的ELISA鑒定結果。圖4為Pep1序列與人工接種CSFV的ELISA鑒定結果。具體實施方式以下結合實施例對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細說明。實施例1分子對接及虛擬肽庫的篩選1、E2蛋白的準備從PDB數據庫中搜尋黃病毒科病毒E2蛋白的晶體結構(4JNT)，借助計算機程序對晶體結構進行分析，選定其第800到900氨基酸殘基作為對接設定區域，以進行分子對接。2、虛擬多肽庫的設計建立不同氨基酸殘基的空間結構，借助計算機程序，實現對輸入目標多肽進行批量生成，以滿足分子對接計算機程序的自動調用和處理。虛擬多肽庫均以直鏈形式生成，不對任何側鏈和首尾氨基和羧基進行修飾。單一虛擬多肽庫的生成以不超過四位氨基酸殘基為宜。3、對接結果的評斷分別計算多肽與蛋白結合的自由能，氫鏈，范得華力等力學參數進行綜合評定，以此來判定篩選結果，并篩選得到Pep1，其多肽序列為苯丙氨酸-酪氨酸-賴氨酸-精氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-絲氨酸-絲氨酸(Phe-Tyr-Lys-Arg-Thr-Ser-Ser-Ser，簡寫FYKRTSSS)(SEQIDNO.1)，其與CSFVE2蛋白對接的相互作用位置結果見圖1。實施例2Pep1序列與人工表達CSFVE2蛋白的親和力鑒定1、將人工表達純化的CSFVE2蛋白采用PBS緩沖液(pH7.4)稀釋為1μg/ml(蛋白量計)，采用活潑酯法，分別將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS，1:1)、CSFVE2蛋白注入安裝有氨基芯片的SPR檢測儀中，保證EDC/NHS和CSFVE2蛋白分別與氨基芯片相互作用5min，實施CSFVE2蛋白與氨基芯片的偶聯。偶聯完成后，該傳感器就可以用于測量CSFVE2蛋白與Pep1序列之間的相互作用。2、向傳感器中注入250μlPBS緩沖液(pH7.4)，以最大流速(150μl/min)運行緩沖液，達到信號基線，將緩沖液的流速降至20μl/min，以獲得較為穩定的基線。3、將人工合成并在氨基端生物素化修飾的Pep1干粉使用PBS緩沖液(pH7.4)分別稀成濃度為187.185μM、93.5925μM、46.7962μM、23.3981μM、11.699μM、5.8495μM、0.7311μM的Pep1溶液，從低濃度開始依次向傳感器中注入250μl的Pep1溶液，每次注入樣品均采用20μl本文檔來自技高網...

【技術保護點】
與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合的多肽配基，其特征在于，所述的多肽配基序列為FYKRTSSS。

【技術特征摘要】
1.與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合的多肽配基，其特征在于，所述的多肽配基序列為FYKRTSSS。2.根據權利要求1所述的與豬瘟病毒E2蛋白特定區域結合的多肽配基，其特征在于，包括以所述的多肽配基序列為核心，任何對該多肽配基序列所進行的相應調整或修飾；修飾材料包括但不限制在納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定的蛋白質。3.根據權利要求1所述的與豬瘟病毒E...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王方雨，鄧瑞廣，余秋穎，邢廣旭，楊艷艷，劉運超，滕蔓，郝俊芳，柴書軍，趙東，郭振華，王晶，
申請(專利權)人：河南省農業科學院，
類型：發明
國別省市：河南;41