一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用。稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記，其特征在于，包括以下引物：2Pi2?F：5’?GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG?3’；2Pi2?R：5’?AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT?3’；2WT?R：5’?AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC?3’或2WT?1R：5’?AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC?3’。本發明專利技術簡便快速、成本低廉，適用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規模分子育種的需求。

Functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2 and its application

The invention discloses a functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2 and its application. Functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2, which is characterized in that includes the following primer: 2Pi2 F:5 'GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG 3'; 2Pi2 R:5 AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT '3' 2WT R:5 '; AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC 3' 1R:5 'or 2WT AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC 3'. The invention is simple, fast and low cost, and is suitable for the molecular marker assisted selection of the separated population of Pi2 for improving rice blast resistance, so as to improve the breeding efficiency and meet the requirement of large-scale molecular breeding.

【技術實現步驟摘要】
一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用
：本專利技術屬于農作物分子育種領域，具體涉及一種稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記及其應用。
技術介紹
：我國是世界上年產稻谷最多的國家，水稻產量的穩定性直接關系到國計民生。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是對水稻生產危害最嚴重的病害之一，被稱為水稻的癌癥。目前，發掘和利用廣譜稻瘟病抗性基因來培育抗病的水稻品種是控制稻瘟病的主要措施。傳統的水稻抗病育種依賴于人工接種和植株表型的選擇，費時費力，并且受到病菌菌株和病菌發病條件等的影響，選育效率較低。而利用與目的基因緊密連鎖的分子標記雖然大大提高了育種效率，但應用過程中也存在受到遺傳背景以及遺傳重組的限制，最終輔助選擇失敗。因此，直接對稻瘟病抗性基因進行選擇，是最有效的抗性鑒定方法。其中，利用稻瘟病抗病基因序列，建立與抗病基因完全共分離的特異性標簽，可達到100％選擇的準確性。此外，通過鑒定抗病基因及其等位基因在功能區域的特異性保守序列，進而建立抗病基因及其等位基因在功能區域的特異性標簽，有助于鑒定雜交后代的純雜合基因型，即便擴大選育親本的范圍也同樣適用，大大加速了育種的進程。目前在水稻第6染色體短臂端的Pi2/9基因簇內，至少有10個稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi25,Pi26,Pi50,Pi2-2)定位其中。其中Pi2是一個廣譜抗性基因，在稻瘟病抗性育種方面具有重要的應用價值(Jiangetal.2012)。Pi2、Pi9以及Piz-t已經被成功克隆，彼此之間在核苷酸水平上的一致性范圍為71.8％～98.6％(Quetal.2006,Zhouetal.2006)。目前，跟蹤抗稻瘟病基因Pi2的分子標記一般用緊密連鎖的SSR標記如AP22，距離Pi2均有一定的距離，選擇效率無法達到100％，也無法直接用來檢測水稻樣品中是否含有Pi2基因。利用Pi2的基因序列與日本晴等位基因的序列差異，建立了Pi2基因的共顯性分子標記M-Pi2，此標記雖然可以鑒定Pi2，但是無法區分Pi2和Piz-t，并且無法鑒定出純雜合基因型(Gaoetal.2010)。基于Pi2基因序列單堿基差異得到的分子標記，通過PCR擴增得到的產物，經PstI或HinfI酶切后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，可特異地鑒定出Pi2(Huaetal.2015,Tianetal.2016)，但此方法步驟較為繁瑣，在進行產業化分子育種過程中，需耗費較多的時間和費用。
技術實現思路
：本專利技術的目的是提供一種能夠適用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規模分子育種的需求，特異性高，可以快速鑒定后代分離群體的純雜合基因型的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記。本專利技術的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記，其特征在于，包括以下引物：2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’，其序列如SEQIDNO.1所示；2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’，其序列如SEQIDNO.2所示；2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’，其序列如SEQIDNO.3所示或2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’，其序列如SEQIDNO.4所示。即包括2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-R；或者2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-1R。本專利技術的第二個目的是提供一種檢測是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是純、雜合基因型的方法，其特征在于，包括以下步驟：提取待測水稻基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，分別用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，或者，分別用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，對應下表即可判斷待測水稻基因組中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待測水稻的稻瘟病抗性基因Pi2純、雜合基因型；也就是說提取待測水稻基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，先用2Pi2-F/2Pi2-R進行擴增，如果得到416bp的產物，那么待測水稻含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以該基因組DNA作為模板，分別用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，如果沒有PCR擴增產物，那么該待測水稻就是Pi2純合型；如果擴增得到416bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-R)或419bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-1R)的擴增產物，那么該待測水稻就是Pi2雜合型；用2Pi2-F/2Pi2-R進行擴增，如果不能得到416bp的產物，那么待測水稻不含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以該基因組DNA作為模板，分別用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，擴增得到416bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-R)或419bp(對應引物對2Pi2-F/2WT-1R)的擴增產物，該待測水稻就是Pi2的等位基因純合型。優選，所述的PCR，其反應體系為：DNA模板1.0μL、10μM2Pi2-F0.5μL、10μM2Pi2-R或2WT-R0.5μL、2×TaqPCRMasterMix5μL，其余由雙蒸滅菌水補足至10μL，反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共運行35個循環；72℃延伸5min。本專利技術的第三個目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記在判斷待測水稻基因組中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待測水稻的稻瘟病抗性基因Pi2純、雜合基因型中的應用。本專利技術具有如下明顯的有益效果：(1)本專利技術簡便快速、成本低廉，適用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規模分子育種的需求。(2)本專利技術提供的分子標記特異性高：通過比對Pi2及其等位基因在多個品種中功能LRR區域的保守性和特異性，同時結合已報導的Pi2與Pi9、Piz-t以及其余21個品種在該LRR區域的保守性和特異性(Tianetal.2016)，開發的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R(或者2Pi2-F/2WT-1R)引物對可以特異性的擴增Pi2和其等位基因。(3)本專利技術提供的分子標記可以快速鑒定后代分離群體的純雜合基因型，對于加速育種進程有著重要的作用。(4)本專利技術是在Pi2基因內部的功能LRR區域序列，并且是測定了多個品種后開發的分子標記，因此，即便擴大親本選育范圍，此方法仍然適用。附圖說明圖1為本專利技術實施例1中對多個水稻品種的Pi2及其等位基因在LRR區域的序列對比圖；其中，左邊為對應的水稻品種名稱，右邊為測序序列；虛線框內(下橫線所對應部分)表示Pi2基因與所測序品種在LRR區域特異性的保守序列。圖2為本專利技術實施例1中BL122-Pi2雜合體在該區域序列的測序峰圖；其中，箭頭表示在該位點核苷酸的測序結果為雙峰。圖3為本專利技術實施例1中例舉的已經公開發表的Pi2與Pi9、Piz-t以及其余21個品種在Pi2的LR本文檔來自技高網...

【技術保護點】
稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記，其特征在于，包括以下引物：2Pi2?F：5’?GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG?3’；2Pi2?R：5’?AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT?3’；2WT?R：5’?AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC?3’或2WT?1R：5’?AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC?3’。

【技術特征摘要】
1.稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子標記，其特征在于，包括以下引物：2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’；2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’；2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’或2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’。2.一種檢測是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是純、雜合基因型的方法，其特征在于，包括以下步驟：提取待測水稻基因組DNA，以該基因組DNA作為模板，分別用權利要求1中的引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R進行PCR擴增，檢測PCR擴增產物，或者，分別用權利要求1中的引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張明永，楊武，范甜，夏快飛，曾璇，胡銳，邱迪洋，李茂霖，成太輝，陳建通，
申請(專利權)人：中國科學院華南植物園，
類型：發明
國別省市：廣東,44