一種鑒定植物對根結(jié)線蟲抗性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種鑒定植物對根結(jié)線蟲抗性的方法。本發(fā)明專利技術(shù)提供的方法包括如下步驟：(1)將線蟲接種植物，進(jìn)行培養(yǎng)；(2)完成步驟(1)后，取植物根組織，觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)；(3)完成步驟(1)后，取植物根組織，對植物根組織中的線蟲進(jìn)行計數(shù)；綜合上述結(jié)果判斷植物對線蟲的抗性。本研究將甲苯胺藍(lán)應(yīng)用于根結(jié)石蠟切片的染色，找出最佳染色時間，可以很清晰的觀察到線蟲和巨細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，而且染色時間比較快，效果比較好。針對線蟲個數(shù)的統(tǒng)計，將研磨法和過篩法結(jié)合起來，找出最佳的研磨時間，方便根中線蟲個數(shù)的統(tǒng)計。這兩種方法結(jié)合起來應(yīng)用，可以從線蟲的發(fā)育狀態(tài)和線蟲的個數(shù)兩個方面說明植株對線蟲的抗性。

A method for identification of plant resistance to root knot nematodes

The present invention discloses a method for identifying plant resistance to root knot nematodes. The method provided by the invention comprises the following steps: (1) the nematode inoculation of plants were cultured; (2) the completion step (1), the plant root tissue and developmental state in the plant root tissues were nematodes; (3) the completion step (1), take root tissue to count plant root tissues of nematode; nematode resistance of plants to judge the results. This study will be applied to the root of toluidine blue staining the paraffin sections, find the best dyeing time, can clearly observe the developmental state of nematodes and giant cells, and the dyeing time is fast, the effect is better. According to the statistics of the number of nematodes, the grinding time and the sifting method were combined to find the best grinding time to facilitate the statistics of the number of worms in the root line. The application of two methods from the developmental state of nematode and nematode number shows on nematode resistant plants.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種鑒定植物對根結(jié)線蟲抗性的方法
本專利技術(shù)涉及一種鑒定植物對根結(jié)線蟲抗性的方法。
技術(shù)介紹
近年來根結(jié)線蟲病在設(shè)施蔬菜栽培中越來越嚴(yán)重。根結(jié)線蟲是一種專性寄生線蟲，在植物組織中完成它們的生活史。二齡幼蟲(J2)從接近分生區(qū)部位進(jìn)入植物組織，向著根尖的中柱移動。伴隨著根尖細(xì)胞的發(fā)育和伸長，其可以遷移到根的成熟區(qū)，找到合適的取食位點后，定居下來發(fā)育成為三齡幼蟲(J3)，刺激頭部周圍的4-5個薄壁細(xì)胞形成大型多核的、新陳代謝活躍的巨細(xì)胞，并逐漸形成適合自己生活需要的維管組織，以便于其從巨大細(xì)胞中攝取植物營養(yǎng)，直至發(fā)育為成蟲。雄蟲會離開取食位點，雌蟲會產(chǎn)卵。卵塊會繼續(xù)孵化成J2，再次侵染植物的根組織。在寄主植物和線蟲長期互作的過程中，宿主植物會有某些防御措施來抵抗線蟲入侵或破壞線蟲的發(fā)育。為了觀察根組織中的線蟲發(fā)育情況，常常用一些染色劑對根組織直接進(jìn)行染色，例如棉藍(lán)和乳酚，但是，用這類染色劑染色時，操作起來比較復(fù)雜，同時也是操作人員長期接觸一些有毒的酚類物質(zhì)。隨后研究人員開始用番紅-固綠對根結(jié)的石蠟切片進(jìn)行染色，同時可以觀察線蟲和巨細(xì)胞的發(fā)育情況。但是，用番紅染色一般需要8個小時，染色時間較長。線蟲的個數(shù)統(tǒng)計，一般用貝曼漏斗法或蔗糖離心法來分離根組織中的線蟲，但是貝曼漏斗法的分離效果比較低，不適宜用于線蟲個數(shù)的統(tǒng)計。蔗糖離心法的糖耗比比較大，而且對儀器設(shè)備要求比較高。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種鑒定植物對根結(jié)線蟲抗性的方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了甲苯胺藍(lán)作為染色劑在觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還保護(hù)一種觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)的方法，包括如下步驟：采用甲苯胺藍(lán)作為染色劑，用含有線蟲的植物根組織制作石蠟切片并進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下觀察。所述方法中，采用1％(體積百分比)甲苯胺藍(lán)水溶液對所述石蠟切片進(jìn)行染色。所述染色的時間為10-15min。所述染色時間具體可為10min。具體來說，所述染色程序依次為：(1)將所述石蠟切片置于1％(體積百分比)甲苯胺藍(lán)水溶液中，室溫10min；(2)將所述石蠟切片置于蒸餾水中，室溫15min；(3)將所述石蠟切片置于乙醇中，室溫2min；(4)將所述石蠟切片置于1體積份二甲苯和1體積份乙醇的混合溶液中，室溫1min；(5)將所述石蠟切片置于二甲苯中，室溫1min。所述石蠟切片的制作方法依次包括如下步驟：固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烘片和脫蠟。所述固定具體可為將所述植物根組織置于FAA固定液中固定24h。所述脫水具體可為將固定好的材料依次加入70％乙醇水溶液、85％乙醇水溶液、95％乙醇水溶液和100％乙醇中進(jìn)行梯度脫水(每個梯度30min)。所述透明具體可為將脫水后材料加至由1體積份無水乙醇和1體積份二甲苯組成的混合液中浸泡30min，然后轉(zhuǎn)移至二甲苯中浸泡30min，使材料呈透明狀。所述浸蠟具體可為將所述透明狀材料浸沒于由二甲苯和等體積熔融石蠟(熔點為54-56℃)組成的混合液中，57℃恒溫干燥12h，然后使二甲苯充分揮發(fā)，60℃恒溫干燥2h后棄掉液體，倒入熔融的純石蠟(熔點為56-58℃)，60℃恒溫干燥12h(期間每4個小時換一次純石蠟)。所述包埋具體可為取包埋紙盒，倒入熔融石蠟(熔點為56-58℃)，迅速將浸蠟處理后的組織塊放入包埋紙盒底部，切面朝下，輕提紙盒，平放于冷水表面，待石蠟表面凝固后立即將紙盒按入水中，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。所述切片和展片具體可為取包埋后得到的蠟塊用切片機(jī)切片，攤片機(jī)進(jìn)行展片，蠟帶輕放在水面上(水溫為40℃-42℃)，亮面朝下，將潔凈載玻片一端斜傾入水，將蠟帶緩緩撈起。所述烘片具體可為40℃過夜烘片。所述脫蠟程序具體可為：二甲苯2次，每次10min；1體積份二甲苯+1體積份乙醇，15min；乙醇2次，每次5min；95％乙醇水溶液，5min；85％乙醇水溶液，5min；70％乙醇水溶液，5min；50％乙醇水溶液，5min；30％乙醇水溶液，5min；去離子水，5min。本專利技術(shù)還保護(hù)一種對植物根組織中的線蟲進(jìn)行計數(shù)的方法，包括在計數(shù)前進(jìn)行如下前處理的步驟：取含有線蟲的植物根組織，進(jìn)行凍融處理。所述凍融處理依次包括如下步驟：冷凍、解凍、破碎。所述冷凍指的是-20℃冷凍24h。所述解凍指的是室溫下自然解凍。所述破碎指的是18000rpm攪拌5s。所述破碎具體可采用Joyoung/九陽JYL-C50T榨汁機(jī)進(jìn)行。所述方法還包括將凍融處理后的組織過篩。所述過篩具體可采用200目篩。所述200目篩收集的多為雌蟲，為三齡和/或四齡幼蟲。所述過篩具體可采用600篩過篩。所述600目篩收集的為四齡幼蟲和/或三齡幼蟲和/或二齡幼蟲。所述過篩具體可采用200目篩后再采用600篩過篩。所述600目篩收集的多為二齡幼蟲。本專利技術(shù)還保護(hù)一種鑒定植物對線蟲抗性的方法，包括如下步驟：(1)將線蟲接種植物，進(jìn)行培養(yǎng)；(2)完成步驟(1)后，取植物根組織，采用以上任一所述觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)的方法觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)；(3)完成步驟(1)后，取植物根組織，采用以上任一所述對植物根組織中的線蟲進(jìn)行計數(shù)的方法對植物根組織中的線蟲進(jìn)行計數(shù)。綜合步驟(2)和(3)的結(jié)果判斷植物對線蟲的抗性。所述步驟(1)中，所述接種的方法具體可為：向所述植物莖部注入線蟲懸浮液。所述線蟲懸浮液的濃度具體可為250條/mL。所述線蟲懸浮液具體可為將線蟲置于水溶液中得到的。所述線蟲具體可為二齡幼蟲。所述接種量具體可為500條/株。以上任一所述植物具體可為番茄。所述番茄具體可為LycopersiconesculentumMillcvCastlemart。以上任一所述線蟲為根結(jié)線蟲。所述根結(jié)線蟲具體可為南方根結(jié)線蟲。本研究將甲苯胺藍(lán)應(yīng)用于根結(jié)石蠟切片的染色，找出最佳染色時間，可以很清晰的觀察到線蟲和巨細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，而且染色時間比較快，效果比較好。針對線蟲個數(shù)的統(tǒng)計，將研磨法和過篩法結(jié)合起來，找出最佳的研磨時間，方便根中線蟲個數(shù)的統(tǒng)計。這兩種方法結(jié)合起來應(yīng)用，可以從線蟲的發(fā)育狀態(tài)和線蟲的個數(shù)兩個方面說明植株對線蟲的抗性。附圖說明圖1為不同染色時間的石蠟切片觀察結(jié)果。圖2為不同攪拌時間的根結(jié)線蟲觀察和個數(shù)統(tǒng)計結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術(shù)，但并不限定本專利技術(shù)。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。如無特殊說明，具體實施方式內(nèi)容中的％均代表體積百分比。南方根結(jié)線蟲：參考文獻(xiàn)：劉雪嬌，程春燕，楊樹瓊，等.南方根結(jié)線蟲侵染抗感黃瓜材料根系組織特征觀察[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，37(5)：69-74.；公眾可以從北京農(nóng)學(xué)院獲得。番茄植株(LycopersiconesculentumMillcvCastlemart)：參考文獻(xiàn)：LiC，LiuG，XuC.etal.Thetomatosuppressorofprosystemin-mediatedresponses2geneencodesafattyaciddesaturaserequiredfort本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
甲苯胺藍(lán)作為染色劑在觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
1.甲苯胺藍(lán)作為染色劑在觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)中的應(yīng)用。2.一種觀察線蟲在植物根組織中的發(fā)育狀態(tài)的方法，包括如下步驟：采用甲苯胺藍(lán)作為染色劑，用含有線蟲的植物根組織制作石蠟切片并進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下觀察。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，采用1％甲苯胺藍(lán)水溶液對所述石蠟切片進(jìn)行染色。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述染色的時間為10-15min。5.一種對植物根組織中的線蟲進(jìn)行計數(shù)的方法，包括在計數(shù)前進(jìn)行如下前處理的步驟：取含有線蟲的植物根組織，進(jìn)行凍融處理。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述凍融處理依次包括如下步驟：冷凍、解凍、破碎。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王紹輝，李小曼，趙文超，周小旋，楊瑞，王建立，馮加平，高英健，趙福寬，
申請(專利權(quán))人：北京農(nóng)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11