用于抑制松材線蟲基因表達的成套試劑與方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于抑制松材線蟲基因表達的成套試劑與方法。本發(fā)明專利技術(shù)公開的成套試劑為成套試劑1和成套試劑2，成套試劑1由成套試劑A與降低hsp基因表達的核酸分子組成，成套試劑A由pDE3dBH.qa載體、粗糙脈孢菌dcl?1

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
用于抑制松材線蟲基因表達的成套試劑與方法
本專利技術(shù)涉及生物
中，用于抑制松材線蟲基因表達的成套試劑與方法。
技術(shù)介紹
松材線蟲是國內(nèi)外檢疫性病原物，隨著其大范圍的傳播，對我國松林造成嚴重威脅。RNA干擾技術(shù)(RNAi)在植物寄生線蟲基因功能的研究中得到廣泛應(yīng)用，在應(yīng)用RNAi技術(shù)研究松材線蟲基因功能時以浸泡法較為普遍，但其成本昂貴，且不能連續(xù)干擾。目前急需一種簡單的干擾松材線蟲基因表達的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是如何降低松材線蟲靶標基因的表達以及如何降低松材線蟲高溫敏感性和抑制松材線蟲運動活性。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)首先提供了可用于降低松材線蟲高溫敏感性或降低松材線蟲hsp基因的表達的成套試劑，將該成套試劑命名為成套試劑1。本專利技術(shù)所提供的成套試劑1，由成套試劑A與hsp基因片段組成；所述成套試劑A包括pDE3dBH.qa載體和粗糙脈孢菌；所述hsp基因片段為名稱為hsp-AC和/或hsp-BC的核酸分子；所述hsp-AC為如下a1)-a3)中任一種：a1)序列表中序列1的第7-425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp-BC為如下b1)-b3)中任一種：b1)序列表中序列2的第7-285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)與b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在嚴格條件下與b1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。上述成套試劑1中，所述成套試劑A還可包括pBT6質(zhì)粒。上述成套試劑1中，所述成套試劑A可僅由所述pDE3dBH.qa載體和所述粗糙脈孢菌組成，也可由所述pDE3dBH.qa載體、所述粗糙脈孢菌和所述pBT6質(zhì)粒組成。上述成套試劑1中，所述粗糙脈孢菌可為粗糙脈孢菌株dcl-1-/dcl-2-。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)還提供了可用于抑制松材線蟲運動活性或降低松材線蟲cyc基因或tmy基因的表達的成套試劑，將該成套試劑命名為成套試劑2。本專利技術(shù)所提供的成套試劑2，為成套試劑甲或成套試劑乙；所述成套試劑甲由所述成套試劑A與cyc基因片段組成；所述cyc基因片段為名稱為cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述cyc-AC為如下c1)-c3)中任一種：c1)序列表中序列3的第7-334位所示的cDNA分子或DNA分子；c2)與c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；c3)在嚴格條件下與c1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述cyc-BC為如下d1)-d3)中任一種：d1)序列表中序列4的第7-224位所示的cDNA分子或DNA分子；d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；d3)在嚴格條件下與d1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述成套試劑乙由所述成套試劑A與tmy基因片段組成；所述tmy基因片段為名稱為cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述tmy-AC為如下e1)-e3)中任一種：e1)序列表中序列5的第7-377位所示的cDNA分子或DNA分子；e2)與e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；e3)在嚴格條件下與e1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述tmy-BC為如下f1)-f3)中任一種：f1)序列表中序列6的第7-236位所示的cDNA分子或DNA分子；f2)與f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；f3)在嚴格條件下與f1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)還提供了所述成套試劑A或所述hsp基因片段或所述cyc基因片段或所述tmy基因片段。所述成套試劑A可用于降低松材線蟲靶標基因的表達。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)還提供了抑制松材線蟲靶標基因表達的方法。本專利技術(shù)所提供的抑制松材線蟲靶標基因表達的方法，包括：將降低靶標基因表達的核酸分子導(dǎo)入所述pDE3dBH.qa載體，得到重組載體，將所述重組載體導(dǎo)入所述粗糙脈孢菌，得到重組菌；利用所述重組菌處理松材線蟲，得到所述靶標基因表達降低的松材線蟲。上述方法中，所述重組菌還可含有pBT6質(zhì)粒。上述方法中，所述降低靶標基因表達的核酸分子可為所述靶標基因的全長或任意片段或其兩個任意片段的組合。上述方法中，所述靶標基因為hsp基因；所述降低靶標基因表達的核酸分子可為所述hsp基因片段。所述靶標基因為cyc基因；所述降低靶標基因表達的核酸分子可為所述cyc基因片段。所述靶標基因為tmy基因；所述降低靶標基因表達的核酸分子可為所述tmy基因片段。上述方法中，所述利用所述重組菌處理松材線蟲可為通過喂食所述松材線蟲所述重組菌實現(xiàn)。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)還提供了下述任一應(yīng)用：X1、所述成套試劑A或所述成套試劑1或所述成套試劑2在抑制松材線蟲基因表達中的應(yīng)用；X2、所述成套試劑1在降低松材線蟲高溫敏感性中的應(yīng)用；X3、所述成套試劑2在抑制松材線蟲運動活性中的應(yīng)用。本專利技術(shù)中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本專利技術(shù)的序列1的第7-425位、序列2的第7-285位、序列3的第7-334位、序列4的第7-224位、序列5的第7-377位和序列6的第7-236位的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。實驗證明，利用本專利技術(shù)的成套試劑與方法可以成功抑制松材線蟲靶標基因(hsp、tmy和cyc基因)的表達，進一步可以降低其抗高溫敏感性和抑制其運動活性：喂食通過pDE3dBH.qa載體導(dǎo)入hsp基因片段得到的重組粗糙脈孢菌(dcl-1-/dcl-2--pDE3dBH.qa-hsp)的松材線蟲中hsp基因的表達量、喂食通過pDE3dBH.qa載體導(dǎo)入cyc基因片段得到的重組粗糙脈孢菌(dcl-1-/dcl-2--pDE3dBH.qa-cyc)的松材線蟲中cyc基因的表達量和喂食通過pDE3本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
名稱為成套試劑1的成套試劑，由成套試劑A與hsp基因片段組成；所述成套試劑A包括pDE3dBH.qa載體和粗糙脈孢菌；所述hsp基因片段為名稱為hsp?AC和/或hsp?BC的核酸分子；所述hsp?AC為如下a1)?a3)中任一種：a1)序列表中序列1的第7?425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp?BC為如下b1)?b3)中任一種：b1)序列表中序列2的第7?285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)與b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在嚴格條件下與b1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。

【技術(shù)特征摘要】
1.名稱為成套試劑1的成套試劑，由成套試劑A與hsp基因片段組成；所述成套試劑A包括pDE3dBH.qa載體和粗糙脈孢菌；所述hsp基因片段為名稱為hsp-AC和/或hsp-BC的核酸分子；所述hsp-AC為如下a1)-a3)中任一種：a1)序列表中序列1的第7-425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp-BC為如下b1)-b3)中任一種：b1)序列表中序列2的第7-285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)與b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在嚴格條件下與b1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成套試劑，其特征在于：所述成套試劑A還包括pBT6質(zhì)粒。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的成套試劑，其特征在于：所述粗糙脈孢菌為粗糙脈孢菌株dcl-1-/dcl-2-。4.名稱為成套試劑2的成套試劑，為成套試劑甲或成套試劑乙；所述成套試劑甲由權(quán)利要求1-3中任一所述成套試劑A與cyc基因片段組成；所述cyc基因片段為名稱為cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述cyc-AC為如下c1)-c3)中任一種：c1)序列表中序列3的第7-334位所示的cDNA分子或DNA分子；c2)與c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；c3)在嚴格條件下與c1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述cyc-BC為如下d1)-d3)中任一種：d1)序列表中序列4的第7-224位所示的cDNA分子或DNA分子；d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；d3)在嚴格條件下與d1)限定的核苷酸序列雜交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述成套試劑乙由權(quán)利要求1-3中任一所述成...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉倩，簡恒，王夢，陳永攀，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：北京,11