用于經由RNA干擾調控基因表達的組合物和方法技術

本公開提供了用于經由RNA介導的沉默調控基因表達的組合物和方法。本公開還提供了優化將dsRNA分子加工成小RNA雙鏈體的組合物和方法。本公開還提供了改善dsRNA分子在產生期望的小RNA和促進目標基因的沉默方面的效率的組合物和方法。

Compositions and methods for regulating gene expression via RNA interference

The present disclosure provides compositions and methods for regulating gene expression through RNA mediated silencing. The present disclosure also provides compositions and methods for optimizing the processing of dsRNA molecules into small RNA duplexes. The present disclosure also provides compositions and methods for improving the efficiency of dsRNA molecules in generating desired small RNA and facilitating silencing of target genes.

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于經由RNA干擾調控基因表達的組合物和方法序列表的并入本申請含有經由EFS網絡以電子方式與本說明書一起提交的序列表的電子等效紙件副本以及經由EFS網絡以電子方式與本說明書一起提交的序列表的計算機可讀形式，并且含有名為“P34087US01_SEQ.txt”的文件，并且據此全文以引用方式并入。
本公開提供了用于經由RNA介導的沉默調控基因表達的組合物和方法。本公開還提供了優化將dsRNA分子定向加工成小RNA(sRNA)雙鏈體的組合物和方法。
技術介紹
非轉基因產生的外源核酸分子，例如雙鏈RNA(dsRNA)分子，已經表現為在將植物內源性基因局部施加于植物葉片之后或通過用含有所述核酸分子的溶液浸泡種子來觸發植物內源性基因的沉默。參見美國專利公開No.2011/0296556和2013/0318657(兩者全文以引用方式并入)。因此，可以通過向植物或種子中引入特異性調控負責植物性狀的基因的表達的dsRNA分子來修飾那些性狀。RNA介導的序列特異性基因調控，也稱為RNA干擾(RNAi)，以包含與目標基因的序列互補的RNA鏈的dsRNA開始。然后用RNA酶III相關酶(Dicer)將dsRNA分子加工成約21-24個核苷酸的較短片段。這些片段，稱為小干擾RNA(siRNA)，結合到RNA誘導的沉默復合物(RISC)中。在附加處理后，將siRNA轉化為單鏈RNA，所述單鏈RNA充當引導序列以識別和指導對靶基因轉錄物的切割。植物細胞可產生dsRNA。據報道番茄RNA依賴性RNA聚合酶(RDR)已產生在兩個末端具有1-nt或2-nt的3′-懸垂的dsRNA。參見Schiebel等人，J.Biol.Chem.263：11858-67(1993)；Rajeswaran等人，NucleicAcidRes.，40(13)：6241-54(2012)。期望按照可預測和預程序化的模式將dsRNA加工成siRNA，并且最終加工成單鏈RNA。本申請尤其提供并公開了并入到dsRNA分子中以改善將dsRNA加工成siRNA的可預測性的序列和結構特征，所述siRNA的功能是引導預定靶基因的沉默。因此，本申請提供了在促進基因調控和性狀修飾方面具有更高效力的核酸分子。專利技術簡述本公開提供了用于調控基因表達的組合物和方法。在一方面，本公開提供用于植物中RNAi介導的沉默的外源性觸發分子。在一方面，本公開提供了雙鏈RNA(dsRNA)分子，所述雙鏈RNA(dsRNA)分子包含：a).第一鏈，其包含與靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和b).第二鏈，其在5′至3′方向上包含5′-懸垂，與所述第一鏈基本互補的核苷酸序列，以及2個核苷酸的3′-懸垂，其中所述5′-懸垂為至少5個核苷酸長。在另一方面，本公開提供了dsRNA分子，其包含：a).第一鏈，其在5′至3′方向上包含i).第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列與第一靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸相同；ii).第二核苷酸序列，其包含2個或更多個A；和iii).第三核苷酸序列，其與第二靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸或第一靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸相同；和b).第二鏈，其在5′至3′方向上包含5個核苷酸的5′-懸垂，與所述第一鏈互補的核苷酸序列，以及2個核苷酸的3′-懸垂。在一些實施方案中，第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是相同的。在另一方面，本公開還提供了包含本文公開的dsRNA分子的組合物。在另一方面，本公開提供了包含本文公開的dsRNA分子的植物、植物部分或種子，其中所述dsRNA分子對所述植物、植物部分或種子來說是外源的。在一方面，本公開提供了一種調控至少一種靶基因的表達的方法，所述方法包括將包含本文所公開的dsRNA分子的組合物施加于植物或植物部分的表面，其中所述dsRNA分子包含第一鏈，所述第一鏈包含與靶基因的至少18個連續核苷酸基本上相同的核苷酸序列。在另一方面，本公開還提供了一種提高dsRNA分子在植物、植物部分或種子中產生所需小RNA方面的效率的方法，所述方法包括向植物、植物部分或種子提供本文所公開的dsRNA分子，其中21-24個核苷酸的小RNA的產生定向偏向dsRNA分子的第二鏈的3′端。在一方面，本公開提供了dsRNA分子，其中將dsRNA分子群體加工成一個或多個21-24聚體小RNA(sRNA)優先從具有3′懸垂的末端開始，并且其中由其加工成的可檢測到的21-24聚體sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含與緊鄰3′懸垂的至少15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個或23個核苷酸的第一雙鏈部分的序列相同的序列。在一方面，本公開提供了dsRNA分子，其中在距3′懸垂的3′末端約21至24個核苷酸的位置處用Dicer樣蛋白質第一次切割dsRNA分子，并且其中由所述dsRNA分子群體加工成的可檢測到的21-24聚體sRNA的至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％包含與緊鄰3′懸垂的至少15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個或23個核苷酸的第一雙鏈部分的序列相同的序列。在一方面，本公開提供了dsRNA分子，其中將dsRNA分子群體加工成一個或多個21-24聚體小RNA(sRNA)優先從dsRNA分子的一個末端開始，并且其中由所述dsRNA分子群體加工成的最豐富的可檢測到的21-24聚體sRNA包含與緊鄰3′懸垂的至少15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個或23個核苷酸的第一雙鏈部分的序列相同的序列。在另一方面，從如本文所公開的dsRNA分子群體加工成的第二大最豐富的可檢測到的21-24聚體sRNA包含與緊鄰第一雙鏈部分的序列相同的序列。在一方面，本公開提供了在dsRNA分子的第一末端包含5′懸垂的dsRNA分子，其中將dsRNA分子加工成一個或多個sRNA優先從dsRNA分子的第二末端開始，并且其中所述第一末端和所述第二末端是dsRNA分子的相對末端。在一方面，本公開的dsRNA分子或定向觸發劑包含：包含3′懸垂的第一末端部分，包含5′懸垂的第二末端部分，以及兩個或更多個靶特異性序列，所述兩個或更多個靶特異性序列通過一個或多個接頭序列鄰接。在一方面，本公開提供了定向觸發劑，所述定向觸發劑包含當用Dicer樣蛋白加工成sRNA時具有優先定向性的外源dsRNA分子。在一方面，本公開的定向觸發劑包含3′懸垂。在一些實施方案中，3′懸垂為至少2個核苷酸長。在一些實施方案中，3′懸垂具有序列UA、UU、AA、AU、UG或UC。在另一方面，本公開的定向觸發劑包含5′懸垂。在一些實施方案中，5′懸垂具有高GC含量。在一些實施方案中，5′懸垂是2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個或更多個核苷酸長。在一些實施方案中，5′懸垂為至少5個核苷酸長。在另一方面，定向觸發劑具有在同一鏈上的3′懸垂和5′懸垂。在另一方面，定向觸發劑具有在反義鏈上的3′懸垂和5′懸垂。在另一方面，定向觸發劑具有在有義鏈上的5′本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含：a.第一鏈，其包含與靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和b.第二鏈，其在5'至3'方向上包含5'?懸垂，與所述第一鏈基本上互補的核苷酸序列，以及2個核苷酸的3'?懸垂，其中所述5'?懸垂為至少5個核苷酸長。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.06.23 US 62/015,9501.一種雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含：a.第一鏈，其包含與靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的核苷酸序列；和b.第二鏈，其在5'至3'方向上包含5'-懸垂，與所述第一鏈基本上互補的核苷酸序列，以及2個核苷酸的3'-懸垂，其中所述5'-懸垂為至少5個核苷酸長。2.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述5'-懸垂具有高GC含量。3.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述5'-懸垂為5個核苷酸長。4.根據權利要求3所述的dsRNA分子，其中所述5個核苷酸的5'-懸垂具有序列GCGCG。5.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2個核苷酸的3'-懸垂具有序列UA。6.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈還包含位于與所述靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的所述核苷酸序列的3'的核苷酸GCCAC。7.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述靶核苷酸序列是mRNA的編碼區、5'非翻譯區、3'非翻譯區、內含子、啟動子、增強子、終止子、rRNA、tRNA、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、參與RNA干擾的非編碼RNA以及其任何組合。8.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2個核苷酸的3'-懸垂包含改善所述dsRNA分子的穩定性的至少一種修飾。9.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述2個核苷酸的3'-懸垂包含選自由以下項組成的組中的至少一種修飾：甲基化、硫代磷酸酯添加、鎖核酸(LNA)以及其任何組合。10.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈還包含5'G。11.根據權利要求10所述的dsRNA分子，其中所述5'G與所述靶核苷酸序列不同。12.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈還在所述5'至3'方向上包含：a.第一序列，其與第一靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同；和b.第二序列，其與第二靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同。13.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列來自不同的基因。14.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列來自相同的基因。15.根據權利要求14所述的dsRNA分子，其中所述第一靶核苷酸序列和第二靶核苷酸序列是不連續的。16.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈包含在所述第一和第二序列之間的一個或多個A。17.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'G。18.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'GUA。19.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含5'GAA。20.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第二序列包含3'AA。21.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈的3'端具有高GC含量。22.根據權利要求20所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈的3'端與所述靶核苷酸序列不同。23.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第一序列和第二序列為21個核苷酸長。24.根據權利要求1所述的dsRNA分子，其中加工所述dsRNA分子以產生21個、22個、23個和/或24個核苷酸的siRNA。25.根據權利要求12所述的dsRNA分子，其中所述第一鏈還包含與第三靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的第三序列。26.根據權利要求25所述的dsRNA分子，其中第一鏈還包含與第四靶核苷酸序列的至少18個連續核苷酸基本上相同的第四序列。27.一種雙鏈RNA(dsRNA)分子，其包含：a.第一鏈，其在5'至3'方向上包含：i.第一核苷酸序列，其與第一靶-核苷酸序列的至少18個連續核苷酸相同；ii.第二核苷酸序列...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·伊恩多利諾，J·P·桑切斯，
申請(專利權)人：孟山都技術公司，
類型：發明
國別省市：美國,US