一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示,其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；發(fā)明專利技術(shù)人通過設(shè)計(jì)簡并引物來擴(kuò)增SnATCN基因的保守區(qū)域,然后再通過RACE?PCR的方法從龍葵cDNA中擴(kuò)增得到SnATCN基因的全長DNA序列；同時(shí)發(fā)現(xiàn)龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量變化和SnATCN基因表達(dá)量變化成正相關(guān)關(guān)系，最后將SnATCN基因在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，證實(shí)其能夠激活煙草中花青素的合成，最終驗(yàn)證SnATCN基因?qū)τ诨ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控功能。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及植物基因工程
，具體涉及一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
花青素作為一種廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬于類黃酮類物質(zhì)，存在于27個(gè)科的72個(gè)屬的開花植物中(Sarmaetal.,1997)。作為一種天然色素,花青素是水溶性的并能賦予許多鮮花和水果紫色、藍(lán)色和紅色等顏色,并能促進(jìn)傳粉和種子分散(Shangetal.,2011)。許多研究證實(shí),天然花青素能保護(hù)植物免受一些生物和非生物脅迫(Ballaréetal.,2003)。另外，富含花青素的飲食對(duì)于人類健康具有明顯的保健功能。花青素具有治療某些慢性疾病例如高血糖和抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，以及提高視力的作用。目前，影響植物花青素合成的基因主要分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因兩大類。其中結(jié)構(gòu)基因是直接編碼花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，主要包括CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UF3GT等。這些結(jié)構(gòu)基因參與了花青素合成的不同階段，其中CHS、CHI、F3H等屬于早期結(jié)構(gòu)基因，而DFR、ANS、UF3GT等屬于晚期合成結(jié)構(gòu)基因。而調(diào)控基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的，它們能夠參與調(diào)控以上結(jié)構(gòu)基因的時(shí)空表達(dá)(Holtonetal.,2015)。轉(zhuǎn)錄因子主要是一些MBW(MYB-bHLH-WD40)復(fù)合物，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合花青素合成上游相關(guān)結(jié)構(gòu)基因(PAL、C4H、CHI等)的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控其表達(dá)(Zhangetal.,2015)。bHLH則能夠與MYB互作有利于其形成的復(fù)合物激活花青素下游一些結(jié)構(gòu)基因(DFR、ANS、UF3GT等)的啟動(dòng)子并進(jìn)行表達(dá)(Xuetal.,2015)。而WD40蛋白能夠通過結(jié)合bHLH來維持MBW復(fù)合物的穩(wěn)定性。例如，擬南芥中的AtPAP1/PAP2(MYB)、AtTTG1(WD40)以及AtTT8/GL3/EGL3(bHLH)共同調(diào)控花青素結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而影響擬南芥中花青素的合成(Hichrietal.,2011)。龍葵因具有多種生物活性被作為一種傳統(tǒng)的中藥植物廣泛種植，其具有繁殖快速，結(jié)實(shí)率高的特點(diǎn)。其植株提取物具有消炎，抗菌，抑制腫瘤生長等作用。龍葵中雖然含有豐富的花青素(Huangetal.,2010)，但是目前還沒有研究對(duì)龍葵中花青素的合成調(diào)控機(jī)制，及其相關(guān)基因的克隆和功能驗(yàn)證進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。因此，根據(jù)下述原因，對(duì)龍葵中花青素合成調(diào)控基因的克隆及功能驗(yàn)證具有重大應(yīng)用價(jià)值：(1)Huang(2010)等在通過酸化處理龍葵果實(shí)0.5h后檢測其中花青素含量達(dá)到了1.28mg/g，而Gavrilova(2011)等檢測了作為花青素重要提取來源的藍(lán)莓及黑加侖中的花青素含量，由于品種不同其含量僅為0.41-0.83mg/g以及0.14-1.8mg/g不等。這也暗示高花青素含量的龍葵果實(shí)可作為重要的花青素提取來源；(2)作為花青素重要的潛在提取來源，了解龍葵中花青素的合成調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘新的花青素合成相關(guān)基因，為利用這些相關(guān)基因資源培育高花青素品種植株提供重要理論參考價(jià)值。分離克隆花青素合成調(diào)控基因是對(duì)龍葵中花青素合成機(jī)理研究的前提，但是由于龍葵基因組測序工作還未完成，其基因序列未知，使得從其中克隆分離基因會(huì)有一定難度，也因此很少有研究對(duì)于龍葵中花青素相關(guān)調(diào)控基因的克隆及功能分析進(jìn)行研究報(bào)道。因此，尋找一種龍葵花青素合成調(diào)控基因，以及其簡便可靠的基因克隆方法，以及功能驗(yàn)證方法對(duì)于從龍葵中克隆花青素合成調(diào)控基因及其功能驗(yàn)證是亟待解決的問題之一，該問題的解決將會(huì)為后來發(fā)掘這些花青素合成調(diào)控基因以及利用其作為基因操控對(duì)象培育高花青素含量株系提供重要應(yīng)用價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的專利技術(shù)人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示,其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；專利技術(shù)人通過設(shè)計(jì)簡并引物來擴(kuò)增SnATCN基因的保守區(qū)域,然后再通過RACE-PCR的方法從龍葵cDNA中擴(kuò)增得到SnATCN基因的全長DNA序列；同時(shí)發(fā)現(xiàn)龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量變化和SnATCN基因表達(dá)量變化成正相關(guān)關(guān)系，最后將SnATCN基因在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，證實(shí)其能夠激活煙草中花青素的合成，最終驗(yàn)證SnATCN基因?qū)τ邶埧ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控功能。上述的SnATCN基因是在龍葵基因組序列未知的情況下通過RACE-PCR的方法克隆獲得，接著對(duì)于SnATCN基因的花青素正調(diào)控功能驗(yàn)證是通過將其在煙草中瞬時(shí)表達(dá)誘導(dǎo)花青素積累完成的。專利技術(shù)人專利技術(shù)人首先設(shè)計(jì)簡并引物序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示，從龍葵中克隆得到一個(gè)保守序列，將該保守序列進(jìn)行測序如SEQIDNo.1所示；更進(jìn)一步的，專利技術(shù)人從SnATCN基因保守序列設(shè)計(jì)了3’RACE以及5’RACEPCR的特異性引物，進(jìn)行SnATCN基因的5’cDNA以及3’cDNA末端的擴(kuò)增，將其序列進(jìn)行測序如SEQIDNo.2及SEQIDNo.3所示；最后通過從5’cDNA以及3’cDNA末端序列設(shè)計(jì)SnATCN基因的全長DNA序列特異性擴(kuò)增引物，得到了SnATCN基因的全長DNA序列，如SEQIDNo.4所示,其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。在龍葵中獲得了SnATCN基因后，又對(duì)龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段中花青素含量以及SnATCN基因的表達(dá)量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)成熟，花青素含量不斷提高的同時(shí)SnATCN基因的表達(dá)量也不斷提高，相關(guān)系數(shù)r＝0.93證實(shí)二者之前存在一個(gè)明顯的正相關(guān)關(guān)系。更進(jìn)一步的，本專利技術(shù)人將SnATCN基因克隆到瞬時(shí)表達(dá)載體pGR106中轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(GV3101)，然后在煙草葉片中注射進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SnATCN基因能夠誘導(dǎo)煙草葉片中花青素的合成，同時(shí)隨著煙草中花青素的積累，SnATCN基因的表達(dá)量也不斷提高，相關(guān)系數(shù)r＝0.97也證實(shí)二者之間存在一個(gè)明顯的正相關(guān)關(guān)系。綜上所述，本專利技術(shù)的專利技術(shù)人在國際上首次提供了一個(gè)龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN的DNA序列，以及SnATCN基因的分離克隆和功能驗(yàn)證方法。專利技術(shù)人首先利用RACE-PCR的方法從龍葵中克隆到SnATCN基因的全長DNA序列，然后對(duì)SnATCN基因的表達(dá)水平及其與龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)二者正相關(guān)。最后專利技術(shù)人將SnATCN基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草中進(jìn)行注射，發(fā)現(xiàn)SnATCN基因能夠誘導(dǎo)煙草中花青素的合成，從而驗(yàn)證了SnATCN基因?qū)τ邶埧谢ㄇ嗨睾铣傻恼{(diào)控作用。附圖說明圖1為本專利技術(shù)通過RACE-PCR的方法克隆龍葵中SnATCN基因的膠圖；圖中可見1-4號(hào)泳道分別是SnATCN基因的保守序列(113bp)、5’cDNA末端(564bp)、3’cDNA末端(844bp)以及全長DNA序列(792bp)；圖2為龍葵果實(shí)不同發(fā)育階段花青素含量與SnATCN基因表達(dá)量變化關(guān)系；圖中可見隨著果實(shí)中花青素含量升高(圖2A,B)，SnATCN基因表達(dá)量也出現(xiàn)了類似的變化(圖2C)，相關(guān)系數(shù)r＝0.93證實(shí)二者之前存在明顯的正相關(guān)關(guān)系；圖3為將SnATCN基因克隆到pGR106瞬時(shí)表達(dá)載體并在煙草中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)功能本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN,其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；其編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種龍葵花青素合成調(diào)控基因SnATCN,其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；其編碼的氨基酸序...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁新華，汪少麗，儲(chǔ)昭輝，賈茹，趙長寶，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：山東,37