葡糖淀粉酶變體和編碼它們的多核苷酸制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及葡糖淀粉酶變體。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及編碼這些變體的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞；以及使用這些變體的方法。

Glucoamylase variants and polynucleotides encoding them

The present invention relates to glucoamylase variants. The present invention also relates to polynucleotides encoding these variants, nucleic acid constructs comprising these polynucleotides, vectors and host cells, and methods of using these variants.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】葡糖淀粉酶變體和編碼它們的多核苷酸對序列表的引用本申請包括計算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。專利技術(shù)背景專利
本專利技術(shù)涉及葡糖淀粉酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產(chǎn)生這些變體的方法、以及使用這些變體的方法。還描述了本專利技術(shù)的葡糖淀粉酶用于淀粉轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇、和糖漿(例如葡萄糖)的用途。本專利技術(shù)還涉及一種包括本專利技術(shù)的葡糖淀粉酶的組合物。相關(guān)技術(shù)描述葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原端釋放的一種酶。葡糖淀粉酶由若干絲狀真菌和酵母產(chǎn)生，其中來自曲霉菌屬(Aspergillus)的那些在商業(yè)上最為重要。在商業(yè)上，葡糖淀粉酶用于將已經(jīng)由α-淀粉酶部分水解的含淀粉材料轉(zhuǎn)化成葡萄糖。然后可以使用一種發(fā)酵有機(jī)體將葡萄糖直接或間接地轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物。商業(yè)發(fā)酵產(chǎn)物的實例包括醇類(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有機(jī)酸類(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸鹽、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和CO2)；以及更復(fù)雜的化合物，包括例如抗生素(例如，盤尼西林和四環(huán)素)；酶；維生素(例如，核黃素、B12、β-胡蘿卜素)；激素以及難以合成生產(chǎn)的其他化合物。發(fā)酵過程通常還用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工業(yè)、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生產(chǎn)中)工業(yè)中。最終產(chǎn)物還可以是糖漿。例如，最終產(chǎn)物可以是葡萄糖，但是還可以被葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化成果糖或由幾乎均等的葡萄糖與果糖組成的一種混合物。這種混合物或進(jìn)一步富含果糖的一種混合物是全世界商業(yè)化的最常用的高果糖玉米糖漿(HFCS)。本專利技術(shù)的目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和編碼這些多肽的多核苷酸，并且這些多肽和多核苷酸在發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)過程(例如乙醇生產(chǎn)過程)中提供高產(chǎn)量。WO2011/068803披露了從真菌粘褶菌，特別是從籬邊粘褶菌和密粘褶菌分離的葡糖淀粉酶。WO2014/177546披露了WO2011/068803中披露的親本葡糖淀粉酶的變體。本專利技術(shù)提供了與其親本相比具有改進(jìn)的特性的葡糖淀粉酶變體。專利技術(shù)概述本專利技術(shù)涉及葡糖淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置295的位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。本專利技術(shù)也涉及葡糖淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。在一個另外的方面，本專利技術(shù)涉及葡糖淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置271、或295、或271和295的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。本專利技術(shù)另外涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)這些變體的方法。在另一方面，本專利技術(shù)涉及由含淀粉材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物(具體是乙醇)的方法，該方法包括以下步驟：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)使液化的材料糖化；和(c)用發(fā)酵生物進(jìn)行發(fā)酵；其中使用葡糖淀粉酶變體的至少一種變體進(jìn)行步驟(b)。在另一方面，本專利技術(shù)涉及由含淀粉材料生產(chǎn)糖漿產(chǎn)物的方法，該方法包括以下步驟：(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化；(b)在本專利技術(shù)的變體葡糖淀粉酶的存在下，使液化的材料糖化；在再另一個方面，本專利技術(shù)涉及包括本專利技術(shù)的變體的組合物。在另一方面，本專利技術(shù)涉及該變體葡糖淀粉酶用于生產(chǎn)糖漿或發(fā)酵產(chǎn)物的用途。附圖簡述圖1示出了作為通過HPLC分析的酶活性(AGU/gDS)的函數(shù)的乙醇產(chǎn)量。將選擇的變體葡糖淀粉酶與親本葡糖淀粉酶JGA098和來自瓣環(huán)栓菌(Tc-AMG)、籬邊粘褶菌(Gs-AMG)、血紅密孔菌(Ps-AMG)的野生型葡糖淀粉酶進(jìn)行比較。定義葡糖淀粉酶：術(shù)語“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定義為催化D-葡萄糖從淀粉或相關(guān)寡糖和多糖分子的非還原端釋放的一種酶。出于本專利技術(shù)的目的，根據(jù)實例中所述的程序確定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶單位(AGU)被定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(37℃，pH4.3，底物：23.2mM麥芽糖，緩沖液：0.1M醋酸鹽，反應(yīng)時間：5分鐘)每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶的量。在另一實施例中，本專利技術(shù)的多肽具有SEQIDNO:2的多肽的至少20％、優(yōu)選至少40％、優(yōu)選至少45％、更優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少55％、更優(yōu)選至少60％、更優(yōu)選至少65％、更優(yōu)選至少70％、更優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少85％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少95％以及甚至最優(yōu)選至少100％的葡糖淀粉酶活性。等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變而自然發(fā)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)部的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽方面無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cDNA：術(shù)語“cDNA”意指可以通過從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mRNA分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄物本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指一種多核苷酸，該多核苷酸直接規(guī)定了變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。控制序列：術(shù)語“控制序列”意指為編碼本專利技術(shù)的變體的多核苷酸的表達(dá)所需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生(native)的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。表達(dá)：術(shù)語“表達(dá)”包括涉及變體的產(chǎn)生的任何步驟，包括(但不限于)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語“表達(dá)載體”意指一種線性或環(huán)狀D本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種葡糖淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQ?ID?NO:2的多肽的位置295的位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQ?ID?NO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.10.23 EP 14190070.41.一種葡糖淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置295的位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。2.如權(quán)利要求1所述的變體，進(jìn)一步包括至少在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置32、83、163、169、219、224、303或410的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。3.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的變體，其中取代的數(shù)目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個取代。4.如以上權(quán)利要求中任一項所述的變體，其中該變體包括選自以下各項的取代中的至少一個或多個：295F、295W、224A、224I、224T、32V、83D、163A、163W、169I、219R、303N或410K。5.如上述權(quán)利要求中任一項所述的變體，其中該變體包括以下取代或取代的組合中的至少一個：295W；295W+410K；224I+295F；224T+295W+318V；295F；224A+295F；295W+83D+410K；163A+295W+410K；163W+295W+410K；303N+295W；169I+295W；或32V+219R+295W；其中該變體具有葡糖淀粉酶活性,并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的變體，其中該變體包括以下取代或取代的組合中的至少一個：295W+410K；或163A+295W+410K；其中該變體具有葡糖淀粉酶活性,并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。7.根據(jù)以上權(quán)利要求中任一項所述的變體，其中這些取代選自以下各項：Y295F、Y295W、L224A、L224I、L224T、A32V、S83D、N163A、N163W、V169I、T219R、S303NR410K、和Q318V。8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的變體，該變體相對于親本具有改進(jìn)的特性，其中這一改進(jìn)的特性是降低的葡萄糖抑制。9.一種葡糖淀粉酶變體，包括在對應(yīng)于SEQIDNO:2的多肽的位置271、410、72、77、145、219、303、224、318的一個或多個位置處的取代，其中該變體具有葡糖淀粉酶活性，并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。10.如權(quán)利要求8所述的變體，其中取代的數(shù)目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10個取代。11.如權(quán)利要求9所述的變體，其中該變體包括選自以下各項的取代中的至少一個或多個：72V、77A、145A、219D、271Q、271N、271A、271S、271V、224Q、303E、318W、318F、410A、410Q或410H。12.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的變體，其中該變體包括以下取代或取代的組合中的至少一個：72V+145A；271Q；224Q+271N+410A；77A；77A+271A；271S+318W+410Q；271V+318F+410H；77A+219D；77A+303E；其中該變體具有葡糖淀粉酶活性,并且其中該變體與SEQIDNO:2的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列一致性。13.根據(jù)權(quán)利要求9-12所述的變體，其中這些取代選自以下各項：D72V、L77A、L145A、T21...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：福山志朗，堤紀(jì)子，綾部圭，
申請(專利權(quán))人：諾維信公司，
類型：發(fā)明
國別省市：丹麥,DK