通過cupin超家族的蛋白質(zhì)催化的(R)?選擇性cupin?硝基醛醇反應(yīng)制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及產(chǎn)生手性β硝基醇化合物的方法。本發(fā)明專利技術(shù)特別涉及可對映選擇性催化亨利反應(yīng)的(R)?選擇性cupin?硝基醛縮酶，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin?硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。

The protein catalyzed by Cupin (R) superfamily of selective Cupin nitroaldol reaction

The present invention relates to methods for producing chiral beta nitro alcohol compounds. The invention particularly relates to the enantioselective catalysis of Henry reaction (R) selective Cupin nitro aldolase, including aldehyde or ketone compounds in nitro Alkane Compounds and nitro Cupin aldolase presence into corresponding beta nitro alcohol compounds.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】通過cupin超家族的蛋白質(zhì)催化的(R)-選擇性cupin-硝基醛醇反應(yīng)專利
本專利技術(shù)涉及產(chǎn)生手性β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。本專利技術(shù)特別涉及對映選擇性催化亨利反應(yīng)的(R)-選擇性cupin-硝基醛縮酶。
技術(shù)介紹
生物催化過程對于化工行業(yè)已經(jīng)變得非常重要。當(dāng)生物催化劑的性質(zhì)使兩種對映體中的任一種能夠與手性或前手性化合物的化學(xué)反應(yīng)中優(yōu)先反應(yīng)或形成時，具有特別重要性的是酶的使用。利用酶的這些有利性質(zhì)的基本要求是如在工業(yè)加工中所需的其足量的低成本的可用性、足夠高的反應(yīng)性、選擇性和在工業(yè)加工的實(shí)際條件下的高穩(wěn)定性。β硝基醇為β氨基醇的前體，其是用于生物活性化合物——如用作藥物成分的麻黃堿、苯丁抑制素和鞘氨醇——合成的重要的手性結(jié)構(gòu)單元。硝基醛醇(nitroaldol)或亨利反應(yīng)是用于C-C鍵形成的有機(jī)合成中經(jīng)典命名反應(yīng)之一。由于創(chuàng)建達(dá)兩個新的手性中心的潛力，其能夠?qū)τ尺x擇性和立體選擇性地進(jìn)行硝基醛醇加成對于合成應(yīng)用是至關(guān)重要的。盡管該反應(yīng)已經(jīng)被熟知一個多世紀(jì)(Henry，1895)，但是利用非酶有機(jī)催化劑或手性金屬催化劑的立體特異的方案最近才被開發(fā)。這些方法的發(fā)展是令人印象深刻，但它們?nèi)匀挥性S多缺點(diǎn)，包括長的反應(yīng)時間、并在金屬催化劑的情況下有時極端的反應(yīng)條件、或者在有機(jī)催化劑的情況下選擇性不足。在過去十年中，第一個不對稱的生物催化硝基醛醇反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)針對來自熱帶橡膠樹巴西三葉膠(Heveabrasiliensis)(HbHNL)羥基腈裂解酶(hydroxynitrilelyase)(Purkarthoferetal.,AngewChemIntEdEngl.200645(21):3454-6,Gruber-Khadjawietal.,Adv.Synth.Catal.2007,349,1445–1450,Yuryev,R.；etal.,Biocatal.Biotransform.,(2010)28,348；Yuryev,R.；etal.；Chemcatchem,(2010)2,981))。屬于α/β水解酶超家族的類似HbHNL的來自木薯(Manihotesculenta)的(S)-選擇性MeHNL，也能夠催化(S)-選擇性硝基醛醇反應(yīng)，雖然具有較低的活性和選擇性。催化(R)-選擇性HNL催化的亨利反應(yīng)的第一(R)-選擇性HNL是來自Arabidobsisthaliana的AtHNL(Fuhshukuetal.J.Biotechnol.2011,153,153-159)，其也屬于類似(S)-選擇性硝基醛縮酶的α/β水解酶超家族。相比之下，硝基醛醇反應(yīng)中的活性到目前為止尚未針對來自屬于不同蛋白質(zhì)折疊的Prunusamygdalus(PaHNL)的(S)-選擇性羥基腈裂解酶而顯示。然而，不幸的是，在報告的反應(yīng)條件下在延長的反應(yīng)時間(2小時至4小時)內(nèi)AtHNL的反應(yīng)產(chǎn)物的對映體過量顯著減少，而產(chǎn)率沒有增加(Fuhshukuetal.2011)。施用每mmol苯甲醛40mgAtHNL，Asano和同事實(shí)現(xiàn)了具有50％乙酸正丁酯(30％產(chǎn)率和91％ee)的pH為7的兩相系統(tǒng)中苯甲醛和MeNO2的最高對映體選擇性。通過施用較大量的酶(100mg每mmol底物)進(jìn)一步略微改善了產(chǎn)率和對映體過量。根據(jù)底物和反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)率達(dá)60％或?qū)τ丑w過量達(dá)96％可以通過施用每mmol底物40mgAtHNL和2小時的反應(yīng)時間實(shí)現(xiàn)。然而，其在相同的反應(yīng)條件下不能共存。然而，在報告的反應(yīng)條件下在延長的反應(yīng)時間(2小時至4小時)內(nèi)AtHNL反應(yīng)產(chǎn)物的對映體過量顯著減少，而產(chǎn)率沒有增加。沒有使用硝基乙烷。Gotor和同事報道了通過水中載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)的硝基醛醇反應(yīng)的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的催化，其可以被歸類為有機(jī)催化，因?yàn)榭茖W(xué)家的觀察導(dǎo)致非特異性蛋白催化的結(jié)論。(Busto,E.；Gotor-Fernandez,V.；Gotor,V.,Org.ProcessRes.Dev.,(2011)15,236)。生物催化的硝基醛醇反應(yīng)也報道于酶(有關(guān)綜述，參見Milner,S.E.；etal.,Eur.J.Org.Chem,(2012),3059)，諸如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Tang,R.C.；etal.,J.Mol.Catal.B:Enzym.,(2010)63,62)、水解酶(Wang,J.L.；etal.,J.Biotechnol.,(2010)145,240)、蛋白酶(Lopez-Iglesias,M.；etal.,Adv.Synth.Catal.,(2011)353,2345)、脂肪酶(Le,Z.-G.；etal.,GreenChem.Lett.Rev.,(2013)6,277；Xia,W.-J.；etal.,Molecules,(2013)18,13910)、酰基轉(zhuǎn)移酶(Xia,W.-J.；etal.,Molecules,(2013)18,13910)和葡糖淀粉酶(Gao,N.；etal.,RSCAdv.,(2013)3,16850)，但在所有情況下，反應(yīng)不是對映選擇性或均沒有提供關(guān)于對映體選擇性的數(shù)據(jù)。因此，到目前為止，只有具有α/β水解酶折疊的植物HNL能夠催化對映選擇性的硝基醛醇反應(yīng)。另一種方法是化學(xué)-酶促方法，其中立體異構(gòu)體的化學(xué)合成的混合物通過酶動力學(xué)拆分，例如使用水解酶來分離。然而，動力學(xué)拆分的主要缺點(diǎn)一般是產(chǎn)率被限制為50％最大值。因此，仍然需要新的硝基醛縮酶，其可以對映選擇性催化亨利反應(yīng)。最近，具有cupin折疊的新細(xì)菌HNL的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被報道(Hajnal,I.；etal.,FebsJ.,(2013)280,5815；Hussain,Z.；etal.,Appl.Environ.Biotechnol.,(2012)78,2053)，但只顯示非常低的特異性活性。新的酶之一，GtHNL，被詳細(xì)表征，其結(jié)構(gòu)被分析(Hajnal,I.；etal.,FebsJ.,(2013)280,5815；A.；etal.,ActaCrystallogr.F,(2012)68,451)。它是具有約15kDa分子量的小的金屬依賴性的單cupin，其形成四聚體。專利技術(shù)概要本專利技術(shù)的目的是提供用于產(chǎn)生β硝基醇化合物的改善的方法。該方法包括提供醛或酮化合物和在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下將化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的β-硝基醇化合物的步驟。本專利技術(shù)特別涉及(R)-選擇性cupin-硝基醛縮酶，其可以對映選擇性催化亨利反應(yīng)。附圖說明圖1A：GtHNL(PDB-代碼:4BIF)的結(jié)構(gòu)的一個cupin單體的卡通表示。1B：SEQIDNO:1、NO:3和NO:5-10的多序列比對。圖2：AcHNL和GtHNL以及GtHNL的三重變體(GtHNL-A40H/V42T/Q110H,簡短:GtHNLmut)和AcHNL(AcHNL-A40H/V42T/Q110H,簡短:AcHNLmut)與苯甲醛(20μmol)和硝基甲烷(1mmol)在具有50％TBME的雙相系統(tǒng)中的硝基醛醇反應(yīng)。使用澄清的裂解物(酶/mmolBA的量是指酶本身，假設(shè)總裂解物蛋白的約50％是HNL)或者純化的酶。轉(zhuǎn)化率和ee本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種產(chǎn)生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin?硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.06.12 EP 14172208.21.一種產(chǎn)生β硝基醇化合物的方法，其中醛或酮化合物在硝基烷烴化合物和cupin-硝基醛縮酶的存在下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的β硝基醇化合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)圖1A的保守桶結(jié)構(gòu)域。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄CL0029的cupin超家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述cupin-硝基醛縮酶包含具有PFAM登錄PF07883的cupin超家族的保守桶結(jié)構(gòu)域。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中式I的化合物與式II的化合物在cupin-硝基醛縮酶的存在下反應(yīng)，得到式III的β硝基醇化合物其中，R1和R2彼此獨(dú)立地來自H、C1-20烷基、C3-10環(huán)烷基、C4-20環(huán)烷基烷基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基、3-14元雜環(huán)烷基、4-20元雜環(huán)烷基烷基、5-20元雜芳基或6-20元雜芳基烷基，任選被一個或多個Ra取代；R3和R4彼此獨(dú)立地來自H或C1-20烷基，任選被一個或多個Ra取代；和每個Ra獨(dú)立地是H、鹵素、-CF3、-ORb、-NRbRb、-(CH2)nCOORb、-(CH2)nC(＝O)Rb、-(CH2)nCONRbRb、C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和各自的Rb獨(dú)立地為H或任選地取代的C1-20烷基、C2-20烯基、或C2-20炔基；和n為0、1、2或3。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述反應(yīng)在單或雙相系統(tǒng)或在乳液中進(jìn)行。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述β硝基醇化合物在至少55％，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少75％對映體過量(e.e.)下獲得。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述β-硝基醇化合物在至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少50％的轉(zhuǎn)化率下獲得。9.cupin-硝基醛縮酶，能夠催化非對稱β硝基醇反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)化率為至少10％，優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少50％。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的cupin-硝基醛縮酶，其中所述cupin-硝基醛縮酶包含根據(jù)圖1A的保守桶...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：克斯廷·斯坦納，曼達(dá)娜·格魯伯，羅馬納·維德尼爾，赫爾穆特·施瓦布，
申請(專利權(quán))人：帕西昂奧地利有限兩合公司，
類型：發(fā)明
國別省市：奧地利,AT