一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備及應用技術

本發明專利技術涉及一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備及應用，金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物作為基底材料，甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1?丁基吡啶四氟硼酸鹽作為信號標記物，檢測前列腺特異性抗原夾心型免疫傳感器的制備及應用，屬于新型功能材料、生物傳感檢測技術領域。該免疫傳感器是在一個傳感平臺通過差分脈沖伏安法和計時電流法產生不同的電化學信號建立起來的，兩種平行方法的對比提高了傳感器的分析性能和臨床可靠性，從而對判斷結果的準確性具有重要的意義。

【技術實現步驟摘要】
一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備及應用
本專利技術涉及一種基于雙信號響應夾心型免疫傳感器的制備及應用，屬于新型功能材料與生物傳感檢測

技術介紹
前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在男性各種癌癥中死亡率排名第二。早期檢測腫瘤標記是癌癥早期診斷的有效方法之一。前列腺特異性抗原(PSA)，作為一個可靠的腫瘤標志物，濃度直接與患前列腺癌的概率相關。一般來說，PSA含量在4.0~10.0ng/mL之間表明前列腺癌的概率為25%~40%，如果PSA含量大于10ng/mL患癌癥的風險顯著增加到67%。目前已有在臨床檢測前列腺特異性抗原-PSA方法有放射免疫分析、酶聯免疫分析、化學發光免疫分析等。電化學免疫傳感器通過把免疫學方法和電化學方法相結合的一種生物傳感器，利用抗原與抗體之間的特異性結合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優點。因此本專利技術制備了一種基于雙信號響應夾心型免疫傳感器，實現了對前列腺特異性抗原的靈敏檢測。YichengWei等利用介孔二氧化鈰/石墨烯復合物構建了電化學免疫傳感器，介孔二氧化鈰/石墨烯復合物比石墨烯具有更大的比表面積，增加了八面體鈀的負載量，提高了傳感器的靈敏度。該傳感器的檢測范圍為1pg/mL~50ng/mL，檢測線為0.33pg/mL。專利（201510664183.1）基于花狀金鉑-花狀二氧化鈰-氧化石墨烯構建的嘔吐霉素傳感器的制備方法及應用，花狀二氧化鈰-氧化石墨烯比石墨烯具有更大的比表面積，增加了花狀金鉑的負載量，提高了傳感器的靈敏度。該傳感器的檢測范圍為2pg/mL～20ng/mL，檢測線為1.6pg/mL。本專利技術利用吸附在介孔二氧化鈰上的甲苯胺藍產生電化學信號。介孔二氧化鈰具有豐富的孔洞結構和良好的吸附性，這些特性使介孔二氧化鈰對甲苯胺藍有一個大的吸附容量并且又有效地防止了甲苯胺藍的泄漏。羧甲基殼聚糖摻雜1-丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體的引入，進一步增加了介孔二氧化鈰對甲苯胺藍的吸附容量和防泄漏能力。此外，該離子液體還具有促進電子轉移和增加傳感器的穩定性和靈敏度的作用。硫化鈷/氧化石墨烯復合物具有大的比表面積，高效的催化性，用金納米粒子功能化后，利用金與氨基的成鍵作用去固定捕獲抗體，增加了免疫傳感器的穩定性和靈敏度。進行差分脈沖伏安法測試時，金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物不產生電化學信號，但是其良好的導電性增加了傳感器的靈敏度。進行計時電流法測試時，介孔二氧化鈰沒有催化雙氧水的作用，但是其空間位阻降低了金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物催化雙氧水產生的信號，增加傳感器的靈敏度。該免疫傳感器是在一個傳感平臺通過差分脈沖伏安法和計時電流法產生不同的電化學信號建立起來的，兩種平行測定方法的結合提高了傳感器的分析性能和臨床可靠性。該方法成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速，而且制備過程簡單，為目前有效檢測前列腺特異性抗原提供了新途徑。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是以金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物為基底材料，以甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸鹽為信號標記物構建了一種雙響應、無酶、快速且超靈敏的夾心型電化學免疫傳感器。本專利技術的目的之二是利用金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物基底和甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸鹽信號標記物之間的相互作用增加了免疫傳感器的穩定性和靈敏度。本專利技術的目的之三是在一個傳感平臺上，分別用差分脈沖伏安法和計時電流法實現了對前列腺特異性抗原的檢測，通過兩種平行方法的對比提高了傳感器的分析結果的準確性和臨床可靠性。本專利技術的技術方案如下：(1)金納米粒子的制備將100mL，質量分數0.01%HAuCl4溶液加熱至沸騰，接著將1.5mL，質量分數1%)檸檬酸三鈉溶液加入并保持30分鐘，在大約1分鐘后沸騰溶液變成了酒紅色，冷卻至室溫備用。(2)硫化鈷/氧化石墨烯復合物的制備首先，將0.4mmol乙酸鈷和1.6mmolL-半胱氨酸溶解在60mL蒸餾水，攪拌30分鐘；接著，再加入100mg的氧化石墨烯，攪拌30min后，轉移到高壓反應釜中，在200oC條件下，反應10h，反應結束冷卻至室溫，用去離子水洗滌3次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到的黑色粉末為硫化鈷/氧化石墨烯復合物。(3)金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物的制備取上述產物50mg硫化鈷/氧化石墨烯復合物放入錐形瓶中，加入60mL上述金納米粒子懸浮液，超聲30min，震蕩12h，復合結束后，用去離子水洗滌3次，最后用無水乙醇洗一次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物。(4)氨基化的納米介孔二氧化鈰的制備將1mL高純水，1.0g硝酸鈰置于錐形瓶中，在攪拌下加入1mL丙酸和30mL的乙二醇，攪拌30min后，轉移到高壓反應釜中，在180oC條件下，反應200min，反應結束冷卻至室溫，用去離子水洗滌3次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到粉末為納米介孔二氧化鈰；接著，取上述產物納米介孔二氧化鈰0.1g放入三口燒瓶中，加入20mL無水乙醇，超聲30min，接著加入0.2mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴鍋中，在70oC條件下，回流1.5h，待反應結束后，冷卻至室溫，用去離子水洗滌3次，最后用無水乙醇洗一次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末為氨基化的納米介孔二氧化鈰。(5)甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體標記矩陣的前列腺特異性抗原檢測抗體溶液的制備將1.5mg的氨基化的納米介孔二氧化鈰、10mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、2mmol的N-羥基琥珀酰亞胺和1mL的濃度為10μg/mL前列腺特異性抗原檢測抗體混合，在4oC震蕩12h，離心洗滌；然后，將1mL、2mg/mL的甲苯胺藍加入在沉淀物中，在4oC震蕩12h，離心洗滌；最后，1mL質量分數為1%羧甲基殼聚糖和濃度為0.8mg/mL1-丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體加入在沉淀物中，在4oC震蕩2h，離心后，得到的甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體標記矩陣的前列腺特異性抗原檢測抗體孵化物重新分散于1mL、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，于4oC冰箱中儲存備用。本專利技術的有益成果（1）本專利技術首次在一個傳感平臺通過差分脈沖伏安法和計時電流法產生不同的電化學信號建立起來的。（2）本專利技術首次將金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物引入電化學免疫傳感器作為基底材料，利用其對雙氧水具有高效的催化性和良好的導電性。（3）本專利技術利用介孔二氧化鈰大比表面積和良好的吸附性能，吸附甲苯胺藍直接產生電化學信號。將羧甲基殼聚糖摻雜1-丁基吡啶四氟硼酸鹽的離子液體引入，與介孔二氧化鈰共同增加了甲苯胺藍的吸附容量并有效地防止其泄漏，此外具有促進電子轉移的作用。（4）本專利技術利用金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)依次用1.0、0.3、0.05?μm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5?mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在?0.2~0.6?V電位下掃描，使峰電位差小于110?mV；(2)用6?μL濃度為0.3?~?1.6?mg/mL金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；(3)繼續將6?μL濃度為8?~?12?μg/mL的前列腺特異性抗原捕獲抗體溶液滴加到修飾電極表面，4?oC下晾干，超純水沖洗；(4)用6?μL質量分數為0.05?~?0.15%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，4?oC下晾干，超純水沖洗；(5)將6?μL濃度為0.0005?~?50?ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原滴加到修飾電極表面，4?oC下晾干，超純水沖洗；(6)將6?μL濃度為0.3~?1.5?mg/mL的甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1?丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體標記矩陣的前列腺特異性抗原檢測抗體溶液滴在電極上，室溫下孵化1?h，清洗后，晾干，冰箱中儲存備用。...

【技術特征摘要】
1.一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，用超純水清洗干凈，然后將電極置于5mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2~0.6V電位下掃描，使峰電位差小于110mV；(2)用6μL濃度為0.3~1.6mg/mL金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物溶液滴加到電極表面，室溫下晾干；(3)繼續將6μL濃度為8~12μg/mL的前列腺特異性抗原捕獲抗體溶液滴加到修飾電極表面，4oC下晾干，超純水沖洗；(4)用6μL質量分數為0.05~0.15%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，4oC下晾干，超純水沖洗；(5)將6μL濃度為0.0005~50ng/mL的一系列不同濃度的前列腺特異性抗原滴加到修飾電極表面，4oC下晾干，超純水沖洗；(6)將6μL濃度為0.3~1.5mg/mL的甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸鹽離子液體標記矩陣的前列腺特異性抗原檢測抗體溶液滴在電極上，室溫下孵化1h，清洗后，晾干，冰箱中儲存備用。2.如權利要求1所述的一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備方法，所述金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物的制備，其特征在于，包括以下步驟：(1)金納米粒子的制備將100mL，質量分數0.01%HAuCl4溶液加熱至沸騰，接著將1.5mL，質量分數1%檸檬酸三鈉溶液加入并保持30分鐘，在大約1分鐘后沸騰溶液變成了酒紅色，冷卻至室溫備用；(2)硫化鈷/氧化石墨烯復合物的制備首先，將0.4mmol乙酸鈷和1.6mmolL-半胱氨酸溶解在60mL蒸餾水，攪拌30分鐘；接著，再加入50~100mg的氧化石墨烯，攪拌30min后，轉移到高壓反應釜中，在200oC條件下，反應10h，反應結束冷卻至室溫，用去離子水洗滌3次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到的黑色粉末為硫化鈷/氧化石墨烯復合物；(3)金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物的制備取上述產物30~50mg硫化鈷/氧化石墨烯復合物放入錐形瓶中，加入50~70mL上述金納米粒子懸浮液，超聲30min，震蕩12h，復合結束后，用去離子水洗滌3次，最后用無水乙醇洗一次，轉速為8000rpm，離心5min，在50oC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末金納米粒子功能化的硫化鈷/氧化石墨烯復合物。3.如權利要求1所述的一種同時用兩種方法互相驗證型免疫傳感器的制備方法，所述甲苯胺藍/氨基化的介孔二氧化鈰/羧甲基殼聚糖/1-丁基吡啶...

【專利技術屬性】
技術研發人員：魏貽成，魏琴，吳丹，張勇，王歡，王雪瑩，范大偉，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：山東,37