一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法技術

本發明專利技術公開了一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法，包括以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行體細胞胚誘導、增殖培養產生次生胚，或者進行胚性愈傷的誘導、分化不定芽等技術環節。本發明專利技術首次建立了閩楠未成熟合子胚的體細胞胚及胚性愈傷的誘導、培養技術體系，明確取材最佳時間，篩選出優良體細胞胚、胚性愈傷誘導培養基、增殖培養基、體細胞胚萌發培養基、分化培養基，有效提高了體細胞胚誘導率、增殖率、體細胞胚萌發率、分化系數等，有助于緩解閩楠種苗供應嚴重不足的現狀。此外，本發明專利技術胚性愈傷的成功誘導，為進行體細胞融合、種質資源保存、基因轉化及優良雜交組合擴繁提供了技術保證。

A method for somatic embryo and adventitious bud induction of Phoebe

The invention discloses a phoebebournei somatic embryo and adventitious bud induction method, including bournei immature seeds as materials, the stripping of immature embryos immature seeds were used as explants for somatic embryo induction and secondary embryo formation or proliferation culture, embryogenic callus induction, adventitious bud differentiation and other technical aspects. The present invention is established for the first time, inducing culture system of phoebebournei immature zygotic embryos of somatic embryos and embryogenic callus were clear, the best time to select excellent somatic embryos and embryogenic callus induction medium, proliferation medium, somatic embryo germination medium, differentiation culture medium, effectively improve the body somatic embryo induction rate and proliferation rate, somatic embryo germination rate, differentiation coefficient, help to alleviate the situation of insufficient supply of Phoebe bournei seedlings. In addition, the invention of embryogenic callus was induced by somatic cell fusion, germplasm preservation, genetic transformation and multiplication of superior cross combinations provides technical assurance.

【技術實現步驟摘要】
一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法
本專利技術屬于植物生物
，具體涉及一種閩楠體細胞胚誘導、培養方法。
技術介紹
閩楠(Phoebebournei(Hemsl.)Yang)，中國特有，是國家二級珍稀漸危種(傅立國，金鑒明.中國植物紅皮書稀有瀕危植物，科學出版社，1991)。閩楠為樟科常綠大喬木，分布于中亞熱帶常綠闊葉林地帶的江西、福建、浙江南部、廣東、廣西等地(中國科學院中國植物志編輯委員會中國植物志:第31卷，北京:科學出版社，1982.)。閩楠木材芳香耐久，淡黃色，材質致密堅韌，不易反翹開裂，易加工，削面光滑，紋理美觀，為上等建筑、家具、造船及工藝雕刻等良好木材，同時，其樹體高大，四季翠綠，是園林綠化優良樹種。可見，閩楠具有極高的經濟價值、社會價值、生態價值、觀賞價值。但閩楠現存資源極少，保護和擴繁優異種質資源成為該種研究的熱點與重點。閩楠自然繁殖主要通過種子繁殖，但種子大小年現象突出，且種子在野外保存壽命短，發芽率極低，因此導致閩楠資源極少。近些年，大量的科研工作者開始研究閩楠種苗保育相關技術，但多集中在閩楠種子活力、休眠、萌發(李鐵華、文仕知、彭險峰等，2003,2009,2010)、育苗(劉軍、姜景民、陳益泰等，2011)等方面，組織培養技術雖然也有見相關報道(曲芬霞和陳存及，2010)，但其增殖率較低，而利用現代生物技術對閩楠進行胚性愈傷組織及體細胞胚誘導培養的快繁技術未見研究報道。目前落葉松、云杉、杉木等針葉樹種已有較完善的體細胞胚發生體系，但不同樹種特別是闊葉樹種對體細胞胚培養技術要求差異顯著，幾乎每一樹種體細胞胚培養體系的建立都需通過大量的實驗來驗證。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術提供一種閩楠體細胞胚誘導、培養方法。首先，本專利技術提供一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法，其中，體細胞胚誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行體細胞胚的誘導、體細胞胚增殖培養產生次生胚、體細胞胚萌發生根步驟；不定芽誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織分化誘導不定芽、不定芽生根步驟，其中，1)體細胞胚誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D1.0-2.0mg/L、6-BA0.1-1.0mg/L，暗培養；2)胚性愈傷組織誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、6-BA0.1-1.0mg/L，暗培養；2)體細胞胚增殖培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6-BA0.5-1.0mg/L、NAA0.1-1.0mg/L，暗培養；3)胚性愈傷組織分化培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：TDZ0.5-1.5mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。4)體細胞胚萌發生根培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6-BA1.0mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。5)不定芽生根培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：6-BA1.0mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。在本專利技術一個實施方案中，將萌發生根的體細胞胚小苗及時轉接到不含激素的MS培養基中進行壯苗培養，2-3個月后移栽小苗。其中，選取的合子胚優選處于球形胚階段，實驗結果表明，選用該階段的幼嫩合子胚為外植體，其體細胞胚誘導率及胚性愈傷誘導率均比較理想，明顯高于其他的合子胚階段。其中，幼胚接種前，將幼胚置于0.4M蔗糖溶液中，4℃預處理48h。在本專利技術優選的實施方案中，所述體細胞胚誘導培養基為MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D1.5mg/L+6-BA1.0mg/L；體細胞胚增殖培養基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L；體細胞胚萌發生根培養基為MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L。在本專利技術另一優選的實施方案中，所述胚性愈傷組織誘導培養基為MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+IBA1.5mg/L+6-BA1.0mg/L；胚性愈傷組織分化培養基為WPM+TDZ1.5mg/L+IBA0.5mg/L。在本專利技術的一個實施方案中，體細胞胚萌發生根階段、胚性愈傷組織分化階段以及不定芽生根階段為光培養，光量為105μmol·m-2·s-1，光周期為8h·d-1。本專利技術突破了閩楠體細胞胚、胚性愈傷誘導培養技術，集成了閩楠幼嫩合子胚體細胞胚、胚性愈傷的誘導培養技術體系，提高了合子胚體細胞胚誘導率、胚性愈傷誘導率、次生胚增殖系數、胚性愈傷分化率及體細胞胚萌發率，從而提高出苗率。此外，閩楠胚性愈傷誘導技術的攻破，不但可以擴大不定芽繁殖系數，而且也為將來制造人工種子和進行外源基因的導入打下基礎。具體實施方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1篩選閩楠種子幼胚體細胞胚誘導培養基、胚性愈傷組織誘導培養基以未成熟閩楠種子為材料。洗潔劑浸泡1min，自來水沖洗3h，無菌水沖洗2次，75％酒精處理30s，無菌水沖洗3～4次，20％(體積比)NaClO消毒15min，無菌水沖洗3～4次，無菌條件下取出幼胚，0.5M蔗糖中4℃預處理48h，接種于13個含有不同激素組合的MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L固體培養基中進行體細胞胚發生實驗。每個處理接種3個培養皿(規格：90*15mm)，每皿接種幼胚5個，共接種15個，4個重復。培養室相對濕度70％±5％，溫度(24±1)℃，暗培養。接種后每日觀察閩楠幼胚在不同培養基上的生長情況。第20天，除CK外其他培養基上的幼胚明顯膨大或有凸起，之后每日繼續觀察，發現膨大的幼胚發生淡黃色、較疏松的胚性愈傷組織，而凸起的小顆粒陸續地從外植體上脫落，經顯微觀察，脫落的凸起為發育良好的初生胚，可見，在不同的培養條件下，閩楠幼胚可朝兩條途徑發生，直接發生體細胞胚或發生愈傷組織。40天后，對每個培養基上的體細胞胚誘導率和胚性愈傷組織的出愈率進行統計，具體見表1。表1不同激素組合培養基的閩楠幼胚體細胞胚誘導率及出愈率的影響注：體細胞胚誘導率(％)＝發生體細胞胚的幼胚數/接種的總幼胚數*100％出愈率(％)＝發生胚性愈傷組織的幼胚數/接種的總幼胚數*100％從表1看出，不同激素組合對閩楠幼胚體細胞胚誘導率及胚性愈傷組織誘導率影響差異顯著。6號組合即2,4-D1.5mg/L+6-BA1.0mg/L的幼胚體細胞胚誘導率最高，達到45.00％，12號組合即IBA1.5mg/L+6-BA1.0mg/L的幼胚愈傷組織誘導率最高，達到91.67％。從表中還可看出，同個培養基上的出愈率均高出體細胞胚誘導率，而且，在6-BA濃度一致的前提下，相同濃度的IBA比2,4-D更有利于愈傷組織組織的誘導。顯微觀察發現，得到的大部分體細胞胚形態正常，具兩片子葉，而部分體細胞胚的形態異常，通常表現為具3片子葉或多片子葉同時著生于一個胚上。從表1可以總結得出：①有利于幼胚直接發生體細胞胚的最佳培養基為：MS+水解酪蛋白500mg/L+L-谷氨酰胺500mg/L+2,4-D1.5mg/L+6-BA1.0mg/L。②有利于幼胚發生胚性愈傷組織本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法，其特征在于，體細胞胚誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行體細胞胚的誘導、體細胞胚增殖培養產生次生胚、體細胞胚萌發生根步驟；不定芽誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織分化誘導不定芽、不定芽生根步驟，其中，1)體細胞胚誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4?D?1.0?2.0mg/L、6?BA0.1?1.0mg/L，暗培養；2)胚性愈傷組織誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、6?BA0.1?1.0mg/L，IBA1.5mg/L，暗培養；2)體細胞胚增殖培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6?BA0.5?1.0mg/L、NAA0.1?1.0mg/L，暗培養；3)胚性愈傷組織分化培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：TDZ0.5?1.5mg/L、IBA?0.1?0.5mg/L，光培養。4)體細胞胚萌發生根培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6?BA?1.0mg/L、IBA?0.1?0.5mg/L，光培養。5)不定芽生根培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：6?BA?1.0mg/L、IBA0.1?0.5mg/L，光培養。...

【技術特征摘要】
1.一種閩楠體細胞胚及不定芽誘導方法，其特征在于，體細胞胚誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行體細胞胚的誘導、體細胞胚增殖培養產生次生胚、體細胞胚萌發生根步驟；不定芽誘導方法包括：以閩楠未成熟種子為材料，剝取未成熟種子幼胚為外植體，進行胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織分化誘導不定芽、不定芽生根步驟，其中，1)體細胞胚誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、2,4-D1.0-2.0mg/L、6-BA0.1-1.0mg/L，暗培養；2)胚性愈傷組織誘導培養基為含有下述成分的MS固體培養基：谷氨酰胺500mg/L、水解酪蛋白500mg/L、6-BA0.1-1.0mg/L，IBA1.5mg/L，暗培養；2)體細胞胚增殖培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6-BA0.5-1.0mg/L、NAA0.1-1.0mg/L，暗培養；3)胚性愈傷組織分化培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：TDZ0.5-1.5mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。4)體細胞胚萌發生根培養基為含有下述成分的MS固體培養基：6-BA1.0mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。5)不定芽生根培養基為含有下述成分的WPM固體培養基：6-BA1.0mg/L、IBA0.1-0.5mg/L，光培養。2.根據權利要求1所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：童再康，樓雄珍，黃華宏，張俊紅，林二培，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：浙江,33