一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法。透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料，結構如下：膠原?羥基磷灰石復合材料中的膠原通過C?N鍵連接透明質酸寡糖，獲得糖基化修飾的礦化膠原復合材料，透明質酸寡糖的分子量為776～5000Da。本發明專利技術首次利用希夫堿反應對膠原進行透明質酸寡糖修飾，可獲得共價結合的糖基化膠原，并首次提出將糖基化膠原作為礦化模板用于骨支架設計中，除了發揮低分子量HA利于細胞遷移、增殖、分化及促創傷愈合的功能外，為體外構建血管化支架提供了新的材料基礎及研究策略。

Mineralized collagen biomimetic bone repairing material modified by hyaluronic acid oligosaccharide and preparation method thereof

The invention relates to a mineralized collagen biomimetic bone repairing material modified by hyaluronic acid oligosaccharide and a preparation method thereof. Mineralized collagen bionic bone repair material, oligosaccharides of hyaluronic acid modified structure is as follows: collagen hydroxyapatite composite material of collagen linked oligosaccharides of hyaluronic acid by C N bond, mineralized collagen composite for glycosylation, molecular weight hyaluronic acid oligosaccharides was 776 ~ 5000Da. The invention uses Schiff base reaction of oligosaccharides of hyaluronic acid modified collagen can be obtained for the first time, glycosylation of collagen covalent binding, and firstly the glycosylation of collagen as template for mineralized bone scaffold design, in addition to their low molecular weight HA for cell migration, proliferation, differentiation and promote wound healing function, provides material basis and research strategy for the new construction of vascularization of scaffold in vitro.

【技術實現步驟摘要】
一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法
本專利技術涉及一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法，屬于生物醫用材料

技術介紹
由創傷、腫瘤、感染及病理因素等造成的骨缺損在臨床中十分常見，成為困擾人類健康生活的難題之一。骨移植已成為僅次于輸血的需求量最大的移植物，而且有逐年增加的趨勢。目前，臨床應用的骨修復材料包括自體骨、異體骨、異種骨、人工骨等，但都存在一定的問題，不能完全解決臨床對骨材料的巨大需求。盡管存在來源有限和二次創傷問題，但自體骨仍是目前臨床效果最好的骨植入材料，一直以來作為骨缺損治療的“金標準”。因此，模仿天然骨的成分和結構，國內外科學家通過體外人工合成的方法，仿生制備了膠原-羥基磷灰石不同形式的復合骨材料，并應用于臨床。但隨著研究的深入和臨床應用跟蹤，發現這些材料與自體骨相比存在生物活性不足或骨修復效果不足等缺點，難以取得理想的修復效果。另外，骨是一個高度血管化的組織，而現行組織工程骨的研究多忽略移植物的再血管化，對于大的骨缺損來說，周圍組織滲透營養、氧氣的范圍有限，而植入骨材料的內生血管形成較慢或難以血管化，最終導致移植骨的成骨活性顯著降低，甚至出現組織中央細胞壞死的情況。因此，傳統骨支架材料存在的生物活性不足及血管化問題等仍是組織工程骨研究的重點。透明質酸(HA)是天然的細胞外基質，具有良好的生物相容性及理化性能，可影響細胞的增殖、遷移及分化，尤其是其寡糖oHA具有促血管化和創傷修復及免疫調節的生物活性。目前，透明質酸與膠原等蛋白結合用于組織材料構建的研究較多，但多集中于大分子量透明質酸的使用，至少也是5kD以上的寡聚糖。這主要是因為5kD以下的oHA制備困難且價格昂貴，且分子量越低其在材料設計中的難度也會相應加大。中國專利文獻CN105903081A(申請號201510926063.4)公開了一種新型雙層蛋白多糖基修復材料的制備方法，其中透明質酸與I型膠原(ColI)主要通過電荷及氫鍵作用進行結合，后續經冷凍干燥及熱交聯處理得到三維網狀復合材料，該多糖與膠原的復合材料主要應用于軟組織的修復。在組織工程骨中比較重要的一類基礎材料是膠原/羥基磷灰石復合材料，其制備工藝和成分也在不斷改善，由以往的鈣磷鹽與膠原的機械混合逐漸發展為無機顆粒在膠原等聚合物基體上的定向排列而實現無機成分與有機成分的有效復合，另外也通過引入其他成分來改善膠原力學性能差的缺陷。中國專利文獻CN101590293A(申請號200910149959.0)公開了一種HA(此指羥基磷灰石)/膠原/殼聚糖互穿聚合物網絡支架的制備方法，該法將PVP為模板制得的羥基磷灰石溶膠分散在膠原和殼聚糖共混液中，經兩步交聯后通過減壓、除氣等后處理得到復合支架，雖然該支架中無機顆粒在膠原/殼聚糖基體中分散良好，但整體來看操作過程較多，而且天然骨是以膠原為模板通過非膠原蛋白的調控或膠原與礦物相的相互作用實現鈣磷鹽的成核礦化，并以膠原的自組裝過程為基礎形成的分級結構，骨的這種由微觀到宏觀逐級形成的多級有序結構對骨的性能及功能十分重要，而該文獻中只是將單獨制備的羥基磷灰石交聯結合在聚合物基體上，并未實現骨的微結構仿生。
技術實現思路
針對當前臨床骨移植的巨大需求及現有骨修復材料仍存在的缺陷，本專利技術克服現有技術的不足，提供一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料及其制備方法。本專利技術的技術方案如下：一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料，結構如下：膠原-羥基磷灰石復合材料中的膠原通過C-N鍵連接透明質酸寡糖，獲得糖基化修飾的礦化膠原復合材料，透明質酸寡糖的分子量為776～5000Da。根據本專利技術優選的，所述透明質酸寡糖修飾膠原的載糖質量百分比為0.909％～5.266％。根據本專利技術優選的，所述膠原為I型膠原，膠原分子量為8～12KD。上述透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的結構組裝過程如下：透明質酸寡糖修飾的膠原分子自組裝形成膠原微纖維；糖基化膠原分子調控鈣磷鹽沿微纖維軸向取向排列，進一步組裝形成礦化膠原纖維；礦化膠原纖維進一步組裝形成取向排列的糖基化礦化膠原纖維束(如圖2所示)；通過靜電紡絲，將上述礦化材料組裝成納米纖維仿生骨修復材料(如圖1所示)。一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的制備方法，包括如下步驟：(1)將膠原、透明質酸和NaBH3CN加入反應體系中，36～38℃避光條件下攪拌反應1～3天，然后加入醋酸溶液稀釋，超濾離心，沉淀干燥后，制得糖基化膠原蛋白；所述反應體系為六氟異丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶劑之一與碳酸氫鈉的混合溶液，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.05～0.15M，六氟異丙醇或二甲基酰胺與碳酸氫鈉的體積比為3:(1～3)；所述膠原加入反應體系后的質量濃度為18～22g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為4～6g/L，NaBH3CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L～18g/L；(2)將步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白加入鹽酸中，攪拌溶解，制得濃度為0.5～0.7mg/ml的糖基化膠原蛋白溶液，然后加入CaCl2溶液，混合均勻，靜置8～15min，然后攪拌加入NaH2PO4溶液，調節pH至7，25～38℃靜置2～24h，固液分離，沉淀經洗滌后，干燥，制得糖基化膠原礦化復合材料；所述CaCl2溶液的添加量為步驟(1)中每克膠原添加0.023～0.0913mol的CaCl2；CaCl2與NaH2PO4的摩爾比為(1.5～1.8)：1；(3)將成型劑溶解于六氟異丙醇中，制得質量濃度為2～4％的溶液，然后加入步驟(2)制得的糖基化膠原礦化復合材料，糖基化膠原礦化復合材料劑與成型的質量比為(1～3)：1，混合均勻，靜電紡絲成多孔納米纖維形態，制得透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料；所述成型劑為膠原、聚乳酸或步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白；根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.1M，六氟異丙醇或二甲基酰胺溶劑與碳酸氫鈉的體積比為3:2；所述膠原為I型膠原，加入反應體系后的質量濃度為20g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為5g/L，NaBH3CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中，37℃避光條件下攪拌反應1天。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中，醋酸溶液的質量濃度為5％，稀釋體積倍數為8倍。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中，超濾離心的超濾管為30k，離心條件為：4000g/min，25min/次，超濾次數為3～8次。根據本專利技術優選的，所述步驟(1)中，干燥為真空冷凍干燥。根據本專利技術優選的，所述步驟(2)中，鹽酸的濃度為0.01M。根據本專利技術優選的，所述步驟(2)中，糖基化膠原蛋白溶液的濃度為0.6mg/ml。根據本專利技術優選的，所述步驟(2)中，pH調節劑為濃度為0.1～0.5MNaOH溶液。pH調節過程中，當pH接近或達到6時溶液開始出現渾濁，pH6.2左右時變化波動較大，此時反應仍在進行，繼續攪拌并滴加NaOH溶液至體系pH為7，之后繼續攪拌2h。根據本專利技術優選的，所述步驟(2)中，37℃靜置22～24h；優選的，所述清洗過程為去離子水反復離心清洗3次，8000～10000r/min，離心8m本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料，結構如下：膠原?羥基磷灰石復合材料中的膠原通過C?N鍵連接透明質酸寡糖，獲得糖基化修飾的礦化膠原復合材料，透明質酸寡糖的分子量為776～5000Da。

【技術特征摘要】
1.一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料，結構如下：膠原-羥基磷灰石復合材料中的膠原通過C-N鍵連接透明質酸寡糖，獲得糖基化修飾的礦化膠原復合材料，透明質酸寡糖的分子量為776～5000Da。2.如權利要求1所述的礦化膠原仿生骨修復材料，其特征在于，所述透明質酸寡糖修飾膠原的載糖質量百分比為0.909％～5.266％；優選的，所述膠原為I型膠原，膠原分子量為8～12KD。3.一種透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將膠原、透明質酸和NaBH3CN加入反應體系中，36～38℃避光條件下攪拌反應1～3天，然后加入醋酸溶液稀釋，超濾離心，沉淀干燥后，制得糖基化膠原蛋白；所述反應體系為六氟異丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶劑之一與碳酸氫鈉的混合溶液，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.05～0.15M，六氟異丙醇或二甲基酰胺與碳酸氫鈉的體積比為3:(1～3)；所述膠原加入反應體系后的質量濃度為18～22g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為4～6g/L，NaBH3CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L～18g/L；(2)將步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白加入鹽酸中，攪拌溶解，制得濃度為0.5～0.7mg/ml的糖基化膠原蛋白溶液，然后加入CaCl2溶液，混合均勻，靜置8～15min，然后攪拌加入NaH2PO4溶液，調節pH至7，25～38℃靜置2～24h，固液分離，沉淀經洗滌后，干燥，制得糖基化膠原礦化復合材料；所述CaCl2溶液的添加量為步驟(1)中每克膠原添加0.023～0.0913mol的CaCl2；CaCl2與NaH2PO4的摩爾比為(1.5～1.8)：1；(3)將成型劑溶解于六氟異丙醇中，制得質量濃度為2～4％的溶液，然后加入步驟(2)制得的糖基化膠原礦化復合材料，糖基化膠原礦化復合材料劑與成型的質量比為(1～3)：1，混合均勻，靜電紡絲，制得透明質酸寡糖修飾的礦化膠原仿生骨修復材料；所述成型劑為膠原、聚乳酸或步驟(1)制得的糖基化膠原蛋白。4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，碳酸氫鈉的摩爾濃度為0.1M，六氟異丙醇或二甲基酰胺溶劑與碳酸氫鈉的體積比為3:2；所述膠原為I型膠原，加入反應體系后的質量濃度為20g/L，透明質酸加入反應體系后的質量濃度為5g/L，NaBH3CN加入反應體系后的質量濃度為6g/L；優選的，所述步驟(1)中，37℃避光條件下攪拌反應1天；優選的，所述步驟(1)中，醋酸溶液的質量濃度為5％，稀釋體積倍數為8倍；優選...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳宗剛，張秀麗，栗敏，顧國鋒，郭忠武，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：山東,37