一種寒蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法技術

本發明專利技術公開了一種寒蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法，從寒蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養；將暗培養中的原球莖轉移至分化培養基上，由原球莖分化產生幼苗。本發明專利技術利用寒蘭莖尖培養技術，誘導出原球莖，然后通過原球莖分化獲得寒蘭幼苗。低溫保存原球莖，結合添加適量多效唑，可以大大延長保存時間，減少繼代培養次數，有效保持了種質資源的遺傳特性。保存一定時間后，置于正常溫度和光照條件下培養，能迅速恢復生長，分化出幼苗。

The growth of in vitro conservation and preservation methods of recovery after a cold orchid Germplasm Resources

The invention discloses a method for restoring growth and preservation in vitro after a cold preservation of germplasm resources, the shoot tips from cold new growth of pseudobulbs, the protocorm induction medium surface cultured protocorm, the protocorm of repeated cutting and subculture, so as to produce the required number the protocorm, then the preservation in vitro culture medium for protocorm growth, entered the stage, at 0 to 5 DEG C under the condition of dark culture; dark culture of protocorm transferred to differentiation medium, produce seedlings from protocorm differentiation. The invention uses cold meristem culture, induced protocorm, then obtain kanran seedlings by protocorm differentiation. Cryopreservation of protocorm, combined with the addition of Paclobutrazol, can greatly prolong the storage time, reduce the subculture times, and effectively maintain the genetic characteristics of germplasm resources. After a certain period of time, under normal temperature and light conditions, it can recover rapidly and differentiate into seedlings.

【技術實現步驟摘要】
一種寒蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法
本專利技術涉及一種寒蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法。屬于植物組織培養

技術介紹
寒蘭（學名：CymbidiumkanranMakino）是蘭科蘭屬地生植物，，假鱗莖狹卵球形，包藏于葉基之內。株型修長健美，葉姿優雅俊秀，葉帶形，薄革質，暗綠色，前部邊緣常有細齒?；ǔ榈S綠色并具有淡黃色唇瓣，有濃烈香氣。其繁殖方法一般為分株繁殖，3～4年才能進行一次，繁殖速度較慢。寒蘭種子非常細小、呈粉狀，沒有胚乳，只有一個簡單的胚，外面包著疏松、透明、不易透水的種皮，胚內含有很少的營養物質，絕大部分為脂類物質，自然條件下寒蘭種子很難萌發。因此，傳統的種子保存技術不適用寒蘭種質資源保存。寒蘭多數栽培品種均是由野生種馴化或自然變異篩選而來。從資源上來說，由于對野生國蘭資源的大量采挖，天然資源已遭到了大量破壞，可采集的野生資源越來越少，再加上自身繁殖速度極其緩慢，我國野生寒蘭資源日趨緊缺，有些珍稀品種已瀕臨滅絕，因此，建立科學、有效、實用的寒蘭種質資源保存技術迫在敏捷。通過有計劃的培育、繁殖、發展、保存瀕危的特有種類，才能避免該物種滅絕。組織培養作為植物種質資源離體保存技術已被廣泛使用，在種質資源交換過程中，利用試管苗進行交換不僅運輸成本低，還可避免在交換過程中病蟲害的傳播，也可以解決大田保存占地面積大、費用高等問題。頻繁的離體繼代培養保存技術，在每一次繼代培養過程中都有可能造成交叉污染，多次的繼代培養還會引發遺傳變異，同時，隨著繼代培養數量的增加要耗費大量的人力物力。
技術實現思路
本專利技術的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種寒蘭種質資源離體保存方法。本專利技術還提供了所述離體保存方法保存后恢復生長的方法。為實現上述目的，本專利技術采用下述技術方案：一種寒蘭種質資源離體保存方法，從寒蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5～1mg/L6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，所采用的繼代培養基為VW培養基輔以0.2～0.4mg/L6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用VW培養基輔以2.5mg/L多效唑（PP333）的離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養。優選的，所述莖尖的剝取方法如下：選擇長度為5～7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝去最外層的1～2個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3～4秒，放入質量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3～4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝取大小約為0.5mm的莖尖。優選的，將莖尖置于試管或培養瓶中原球莖誘導培養基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導培養基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標記。優選的，原球莖的培養方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養15天后，出現明顯膨大，30天后出現若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。優選的，反復切割和繼代培養的具體方法是：將生長為4～6mg的原球莖切割成4塊，然后置于繼代培養基中繼續擴增培養，建立無性繁殖系，反復切割和繼代培養，從而短時間繁殖出所需數量的原球莖。優選的，所述發育生長階段是選擇發育健壯、大小均勻的原球莖，置于離體保存培養基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養7天。優選的，暗培養階段應當定期觀察生長情況，隨時剔除有污染的培養瓶。優選的，暗培養階段所使用的離體保存培養基，厚度約為4cm，并且，用于放置離體保存培養基的試管或培養瓶應當密閉良好，以減少離體保存培養基中水分的揮發。進一步優選的，試管或培養瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外層纏繞3層塑料保鮮薄膜。上述離體保存方法保存后恢復生長的方法，將暗培養中的原球莖轉移至分化培養基上，由原球莖分化產生幼苗；所述分化培養基為KC培養基輔以質量濃度10%的香蕉汁，培養溫度25℃，光照強度2000lux，每天光照時間為10小時。優選的，原球莖在分化培養基上接種30天后，在原球莖頂端部分出現由葉原基發育成的幼葉，隨后幼葉迅速生長，待出現第2～3片葉時，原球莖向下伸長，并且有第1條根生出；50天后，等到幼苗有2～3條根，5～6片葉，生長到10cm左右，發育成完整的植株，將試管苗移栽在育苗基質中，在自然條件下生長成正常植株。本專利技術的有益效果：本專利技術是利用寒蘭莖尖培養技術，誘導出原球莖，然后通過原球莖分化獲得寒蘭幼苗。作為繼代培養過程中的原球莖，是分化幼苗的中間體，通過低溫保存原球莖，在離體保存培養基中添加適量多效唑，可以大大延長保存時間，減少繼代培養次數，有效保持了種質資源的遺傳特性。保存一定時間后，將培養物置于正常溫度和光照條件下培養，能迅速恢復生長，分化出幼苗?，F有技術中通常采用的種子萌發及快速繁殖技術，雖然能獲得大量植株，但繁殖后代變異系數較大，遺傳穩定性和品種一致性存在問題，不符合種質資源的保存條件。本專利技術采用莖尖培養作為外植體，莖尖是植物中生長最快的分生組織，遺傳基因穩定，再生能力強，基本不含病毒和其他病源組織（如細菌、真菌等），經過組織培養后可以得到遺傳穩定、品種一致以及健壯的無病毒、無病菌植株，達到了去病菌和快速繁殖的目的，具備了種質資源離體保存的必要條件。一般種質資源離體保存技術大都采用試管幼苗保存，但試管幼苗對溫度反應比較敏感，保存溫度基本都在12℃以上，不利于較低溫度保存。除寒蘭植物之外，其他植物誘導、分化試管苗的中間體大多為愈傷組織，將愈傷組織誘導成胚狀體或不定芽，最終分化生產出試管苗，而愈傷組織誘導率一般比較低，恢復培養后在繼續分化出試管苗的比例也較低，相對于寒蘭原球莖90%以上的分化率，保存愈傷組織需要較高的成本。本專利技術采用原球莖進行離體培養保存，原球莖對溫度的敏感性大大降低，可以有效降低保存溫度，溫度越低，生長速度就越緩慢，保存時間就越長，原球莖在溫度0～5℃范圍內可以緩慢生長；保存設施也相對簡單，在低溫冰柜中采用暗培養保存技術，去掉了光照設施，控溫也相對容易，減少了光能損耗，降低了電能消耗，有效的降低保存成本；在離體保存培養基中輔以多效唑，多效唑為植物生長延緩劑，通過抑制赤霉素的合成，減少細胞的分裂和伸長，降低生長速度，減少了對培養成分的消耗，延長離體培養物的保存時間，保存時間可達到40個月以上。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本專利技術，并不對其內容進行限定。實施例1：一種寒蘭種質資源離體保存及保存后恢復生長的方法，具體步驟如下：（1）從寒蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5mg/L6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖。其中，莖尖的剝取方法如下：選擇長度為5cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝去最外層的1個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3秒，放入質量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝取大小約為0.5mm的莖尖。將莖尖置于試管或培養瓶中原球莖誘導培養基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導培養基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，從寒蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5～1mg/L?6?芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，所采用的繼代培養基為VW培養基輔以0.2～0.4mg/L?6?芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用VW培養基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養。

【技術特征摘要】
1.一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，從寒蘭新生長的假鱗莖上剝取莖尖，將其置于VW培養基輔以0.5～1mg/L6-芐基腺嘌呤的原球莖誘導培養基表面培養成原球莖，將原球莖進行反復切割和繼代培養，所采用的繼代培養基為VW培養基輔以0.2～0.4mg/L6-芐基腺嘌呤，從而繁殖出所需數量的原球莖，然后采用VW培養基輔以2.5mg/L多效唑的離體保存培養基進行培養，待原球莖進入發育生長階段后，在0～5℃條件下暗培養。2.根據權利要求1所述的一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，所述莖尖的剝取方法如下：選擇長度為5～7cm的假鱗莖，用自來水清洗表面塵土，剝去最外層的1～2個葉片，用體積濃度75%的酒精擦洗3～4秒，放入質量濃度0.1%的升汞溶液中滅菌20分鐘，無菌水沖洗3～4次，晾干或用濾紙吸干表面水分，在顯微鏡下剝取大小約為0.5mm的莖尖。3.根據權利要求1所述的一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，將莖尖置于試管或培養瓶中原球莖誘導培養基的表面，輕壓莖尖以接觸到原球莖誘導培養基的表面為宜，避免埋入，進而引起窒息死亡，及時密封并做好標記。4.根據權利要求1所述的一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，原球莖的培養方法是：將莖尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小時的條件下培養15天后，出現明顯膨大，30天后出現若干個白色突起，45天后，所述突起體積增大形成原球莖。5.根據權利要求1所述的一種寒蘭種質資源離體保存方法，其特征在于，反復切割和繼代...

【專利技術屬性】
技術研發人員：顏廷進，戴雙，李群，鄧翠霞，田茜，
申請(專利權)人：山東省農作物種質資源中心，
類型：發明
國別省市：山東,37