腺相關病毒反向末端重復序列突變體及其應用制造技術

本發明專利技術具體涉及腺相關病毒(Adeno-associated?virus，AAV)反向末端重復序列(inverted?terminal?repeats，ITR)突變體及其應用。本發明專利技術設計并合成了一系列AAV的ITR的突變體，對其功能進行了驗證和研究。實施例中，本發明專利技術利用這些突變體ITR替代AAV中的野生型ITR，構建了多種新型腺相關病毒質粒載體。這些含有“所設計的突變體ITR的新型腺相關病毒質粒載體”可成功地包裝成重組腺相關病毒，并能有效地將外源基因轉導至細胞中；與野生型ITR的AAV載體相比，這些含有“所設計的突變體ITR的重組AAV”在體內外轉導中外源基因的表達水平更高，裝載外源基因的容量也更大。本發明專利技術擴大了AAV載體在基因治療及其他基因轉移應用方面的應用范圍。

Adeno associated virus reverse end repeat mutant and uses thereof

The present invention relates to recombinant adeno-associated virus (Adeno-associated virus, AAV) inverted terminal repeat (inverted terminal repeats, ITR) mutant and its application. A series of mutants of AAV ITR are designed and synthesized, and their functions are verified and studied. In the embodiment, the invention utilizes the mutant ITR to replace the wild type AAV in ITR, and constructs a plurality of novel adeno associated virus plasmid vectors. These contain new adeno associated virus vector \the mutant ITR was successfully packaged into recombinant adeno-associated virus, and can effectively reduce the exogenous gene transduction to cells; the AAV vector compared with wild-type ITR, expression levels of these contain\ group AAV \designed mutants of exogenous ITR transduction in vitro and in vivo gene in higher exogenous gene loading capacity is also bigger. The invention expands the application range of the AAV vector in gene therapy and other gene transfer applications.

【技術實現步驟摘要】
腺相關病毒反向末端重復序列突變體及其應用本專利技術屬于生物技術專利
本專利技術具體涉及腺相關病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)反向末端重復序列(invertedterminalrepeats，ITR)突變體及其應用。本專利技術設計并合成了一系列AAV的ITR的突變體，對其功能進行了驗證和研究。實施例中，本專利技術利用這些突變體ITR替代AAV中的野生型ITR，構建了多種新型腺相關病毒質粒載體。這些含有“所設計的突變體ITR的新型腺相關病毒質粒載體”可成功地包裝成重組腺相關病毒，并能有效地將外源基因轉導至細胞中；與野生型ITR的AAV載體相比，這些含有“所設計的突變體ITR的重組AAV”在體內外轉導中外源基因的表達水平更高，裝載外源基因的容量也更大。本專利技術擴大了AAV載體在基因治療及其他基因轉移應用方面的應用范圍。背景一基因治療基因治療是二十世紀八十年代發展起來的一種全新疾病治療模式，它有別于傳統的藥物治療，而是將產生藥物的基因導入人體，以糾正缺陷基因或發揮治療作用。與傳統治療方法相比，基因治療的優勢是明顯的，它一次性給藥，長期持續表達目的基因，持續產生治療效果，且更接近人體基因表達的自然狀態，被認為更安全、更有效。據統計，截止至2015年，全世界已經通過的基因治療臨床方案近4000個，所治療的疾病主要是對人類健康威脅嚴重的、未被滿足臨床需求的各種疾病，具體包括如遺傳病、腫瘤、心血管疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、中樞神經系統疾病、血液病、代謝性疾病及其它各種難治性疾病等.對特定類型的疾病進行基因治療的關鍵技術問題，是將恰當的治療基因安全、有效地導入到人體的預期的組織、器官、細胞中，并使該治療基因長期穩定、可控地表達。基因導入的通常采用的方法有物理/化學方法和生物方法，或者分類為使用病毒類載體進行基因導入和使用非病毒手段進行基因導入等兩類方法。物理/化學方法是通過使用磷酸鈣、電轉、脂質體等將治療基因導入細胞，這種方法安全性好，但效率低，通常處于初級實驗研究階段，有待于產生更有效的技術進步。生物方法是使用對人體有天然感染能力的生物體，主要是以經人工改造后的病毒，即重組病毒作為載體，通過基因重組技術將治療基因的表達單元(或者被稱做基因表達盒)組裝到病毒載體中，通過病毒對目標細胞的感染將治療基因導入人體。病毒載體的轉導效率高，目前絕大多數基因治療方案都是采用病毒載體這種方法。(Morgan，R.A.andW.F.Anderson，Annu.Rev.Biochem.1993；62：191-217).二病毒載體系統目前已有的病毒載體主要有腺相關病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、逆轉錄病毒載體等。1逆轉錄和慢病毒載體逆轉錄病毒載體曾經是使用最多的病毒載體，大多是基于莫羅尼小鼠白血病病毒(MMuLV)改造而來的。逆轉錄病毒載體可以將治療基因插入人體細胞的染色體并穩定地隨細胞的分裂而分裂，使治療基因穩定而持久表達。但由于其插入是隨機的，存在破壞人體正常基因功能的危險。由此人們又開發了基于HIV病毒的慢病毒載體系統，并在血液病的研究和臨床治療中得到越來越廣泛的應用。2腺病毒載體腺病毒載體基因不插入人染色體，且可感染的細胞種類也比逆轉錄病毒多，但由于治療基因不插入染色體，所以需要多次反復用藥，并且腺病毒有很強的免疫原性，在人體中多次使用會激活中和抗體的表達，并降低治療效果。因此，腺病毒載體多用作疫苗載體。3單純皰疹病毒載體單純皰疹病毒載體有轉導效率高、可感染分裂和非分裂細胞、在神經系統中可以逆軸突傳導等特點，因此在神經系統中有較好的應用前景。2015年一種基于I型單純皰疹病毒(HSV1)的溶瘤病毒T-Vee在美國被批準上市，成為第一個上市的單純皰疹病毒藥物。4腺相關病毒載體(AAV載體)AAV載體因為安全性好、感染的宿主范圍廣泛、能穩定表達外源基因而成為有應用前景的病毒載體。2012年，一種基于AAV1的治療脂蛋白酯酶缺乏癥的基因治療藥物Glybera在歐盟批準上市，成為西方國家第一個成功上市的基因治療藥物(-HerttualaS.MolTher.2012；20(10)：1831-1832.)。三腺相關病毒的基本生物學特征1AAV的概述腺相關病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因在腺病毒制品中發現而得名(AtchisonRW，etal.Science.1965；149：754-756.HogganMD，etal.ProcNatlSciUSA.1966；55：1467-1474.)。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成員，依賴病毒屬，包含多種血清型，其基因組為單鏈DNA(RoseJA，etal.ProcNatlAcadSciUSA.1969；64：863-869.)，其中AAV2的基因組大小為4682個核苷酸。AAV是復制依賴型病毒，需要其它病毒如腺病毒、單純皰疹病毒和人乳頭瘤病毒(GeoffroyMC，etal.CurrGeneTher.2005；5(3)：265-271.)，或其它輔助因素提供輔助功能才能復制。野生型的AAV感染細胞后，其基因組會整合到細胞染色體中，在沒有輔助病毒存在時，整合在細胞染色體中的AAV的基因組會保持潛伏狀態(ChioriniJA，etal.CurrTopMicrobiolImmunol.1996；218：25-33.)，而不產生子代病毒，只有當腺病毒、單純皰疹病毒和人乳頭瘤病毒存在的情況下，整合在細胞染色體中的AAV的基因組才會被拯救并包裝、復制產生AAV的子代病毒。2AAV的基因組最早分離到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)(AtchisonRW，etal.Science.1965；149：754-756.)。AAV2基因組長約4.7k，基因組兩端為長度145nt的“反向末端重復序列”(invertedterminalrepeat，ITR)，呈回文-發卡結構(LusbyE，etal.JVirol.1980；34：402-409.)。基因組中有兩個大開放閱讀框(ORF)，分別編碼rep和cap基因。AAV2的全長基因組已克隆至大腸桿菌質粒中(SamulskiRJ，etal.ProcNatlAcadSciUSA.1982；79：2077-2081.LaughlinCA，etal.Gene.1983；23：65-73.)。AAV2基因組左側是rep基因，它編碼AAV的非結構蛋白Rep，分別由p5和p19啟動子起始，各自分別得到經切割和未經切割的mRNA轉錄產物，從而得到四種蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep蛋白的作用是控制AAV的轉錄，參與AAV復制，并在子代基因組的產生和病毒顆粒的組裝中起重要作用。其中Rep78和Rep68與ITR種的末端解鏈位點trs(terminalresolutionsite)和GAGC重復序列表位(repeatmotif)特異性結合，啟動AAV基因組由單鏈向雙鏈的復制過程(Chiorini，J.A.，S.M.Wiener，R.M.Kotin，R.A.Owens，andB.Safer.J.Virol.1994；68：7448-7457)。Rep與DNA結合和末端本文檔來自技高網...

【技術保護點】
腺相關病毒反向末端序列突變體，其技術特征在于：腺相關病毒(Adeno?associated?virus，AAV)中的野生型反向重復序列(inverted?terminal?repeats，ITR)被改造成為截短的新型ITR。

【技術特征摘要】
1.腺相關病毒反向末端序列突變體，其技術特征在于：腺相關病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)中的野生型反向重復序列(invertedterminalrepeats，ITR)被改造成為截短的新型ITR。2.依據權利要求1所述，截短的新型ITR突變體包括分別刪除B/B’、B/B’+C/C’、B/B’+C/C，+1/2(A/A’)、B/B’+C/C’+A/A’(不含trs)，依次命名為ITR-ΔB(SEQIDNO：1)、ITR-ΔBC(SEQIDNO：2)、ITR-ΔBC1/2A(SEQIDNO：3)、ITR-ΔBCA(SEQIDNO：4)。3.依據權利要求2所述，截短的新型ITR突變體在刪除B/B’、B/B’+C/C’的基礎上，繼續刪除D序列及部分trs序列，成為新的突變體，并依次命名為ITR-ΔBDtrs(SEQIDNO：8)、ITR-ΔBCDtrs(SEQIDNO：9)。4.依據權利要求2所述，在AAV載體的一側應用ITR突變體ITR-ΔB、ITR-ΔBC、ITR-ΔBC1/2A、ITR-ΔBCA，其技術特征是可以有效地包裝成AAV病毒及感染細胞，不降低外源基因的表達水平。5.依據權利要求2所述，在AAV載體的兩側應用ITR突變體ITR-ΔB，其技術特征是可以有效地包裝成AAV病毒及感染細胞，增加外源基因的表達水平，并增加至少可增加46bp的包裝容量。6.依據權利要求2所述，在AAV載體的兩側應用刪ITR突變體ITR-ΔBC，其技術特征是可以有效地包裝成AAV病毒及感染細胞，增加外源基因的表達水平，并增加至少可增加68bp的包裝容量。7.依據權利要求3所述，在AAV載體的兩側應用ITR突變體IT...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳小兵，董小巖，周慶璋，
申請(專利權)人：北京五加和分子醫學研究所有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11