浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法，包括類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根步驟。在液體培養(yǎng)基中，類原球莖誘導(dǎo)的優(yōu)選培養(yǎng)條件為TDZ?0.6mg/L+NAA?0.4mg/L，誘導(dǎo)率為62.5%；在固體培養(yǎng)基中，類原球莖誘導(dǎo)的優(yōu)選培養(yǎng)條件為TDZ?0.6mg/L+?NAA?0.2mg/L+6?BA?2.0mg/L，誘導(dǎo)率為59.3%。類原球莖增殖的優(yōu)選培養(yǎng)條件為稀效唑1.5?mg/L+6?BA?1.0mg/L+NAA?0.2mg/L，增殖系數(shù)為8.4，其中稀效唑是類原球莖增殖的主要因子。類原球莖分化的優(yōu)選條件為6?BA?0.5mg/L+NAA?0.1mg/L，分化率為87.3%。植株生根誘導(dǎo)的優(yōu)選培養(yǎng)條件為1/2?MS+NAA?1.0mg/L+IBA?1.0mg/L，生根率達(dá)100%。

Methods to establish the rapid propagation system of Zhejiang jinxianlian tissue culture

The invention discloses a method for establishing Zhejiang Anoectochilus tissue culture rapid propagation system, including PLB Induction, proliferation, differentiation and rooting steps. In the liquid culture medium, culture conditions optimization of PLB Induction for TDZ 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L, the induction rate was 62.5%; in the solid culture medium, culture conditions optimization of PLB Induction for TDZ 0.6mg/L+ NAA 0.2mg/L+6 BA 2.0mg/L, the induction rate was 59.3%. Optimization of culture conditions for the proliferation of protocorm like body of Uniconazole 1.5 mg/L+6 BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L, the multiplication coefficient is 8.4, which is the main factor of Uniconazole protocorm-like proliferation. The optimum conditions of protocorm differentiation for 6 BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L, differentiation rate was 87.3%. Plant root induction optimization of culture condition for 1/2 MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L, the rooting rate was 100%.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法
本專利技術(shù)屬于植物組培領(lǐng)域，尤其是一種涉及浙江金線蓮組織培養(yǎng)體系的建立方法。
技術(shù)介紹
浙江金線蓮（Anoectochiluszhejiangensis）為蘭科開唇蘭屬多年生珍稀草本植物，主要分布在浙江、福建等地，作為一種珍貴中草藥，具有廣闊的開發(fā)利用前景。浙江金線蓮的生物學(xué)特性及藥理活性與同屬基原植物金線蓮相近，對生長條件要求比較嚴(yán)格，自然萌發(fā)率不到千分之一，且自然繁殖時間長且繁殖率不高，再加上近年來人為大量采挖，導(dǎo)致浙江金線蓮野生資源日趨枯竭，因此保護(hù)野生浙江金線蓮已經(jīng)到了刻不容緩的地步。植物組織培養(yǎng)是保護(hù)瀕危植物的有效技術(shù)手段，可在短時間內(nèi)繁殖出大量新生植株。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的篩選將直接影響到組織培養(yǎng)的成功與否，植物激素的濃度配比將直接影響到植株快繁的效率。因此培養(yǎng)基與激素配比的選擇對組織培養(yǎng)的成功與否具有重要作用。迄今有關(guān)金線蓮基原植物，如中國臺灣金線蓮、金線蓮、福建金線蓮等快速繁殖體系的研究已有報道[王勇.金線蓮組織培養(yǎng)新體系建立及優(yōu)化.北方園藝,2010,13:178-179；陳永快,林一心,鄒暉等.福建金線蓮和中國臺灣金線蓮的組培快繁技術(shù).現(xiàn)代園藝,2008,10:9-12.]，并發(fā)現(xiàn)不同基原植物間的快速繁殖體系相差較大，但是關(guān)于浙江金線蓮組織培養(yǎng)方面的研究尚屬空白。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本申請?zhí)峁┝艘环N浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法。一種浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法，包括類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根步驟，其中，類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入植物生長調(diào)節(jié)劑，pH5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中添加質(zhì)量含量10%香蕉泥；１）類原球莖誘導(dǎo)：采用液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中含TDZ0.6mg/L+NAA0.4mg/L；固體培養(yǎng)基含TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L；2）類原球莖增殖：增值培養(yǎng)基中含稀效唑1.5mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，其中稀效唑是類原球莖增殖的主要因子；3）類原球莖分化：對類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)，10天類原球莖球體頂部開始突起變尖，變綠，60天后可分化成帶有莖節(jié)、葉片及幼小毛狀根的小苗，分化培養(yǎng)基中含6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；4）植株生根：分化的幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后開始有根長出，生根培養(yǎng)基中含NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L。所述１）類原球莖誘導(dǎo)，取生長健康的無菌苗，在超凈工作臺上將其葉片從柄部切除，氣生根從基部切除，將莖切成含2-4個節(jié)的莖段。所述１）類原球莖誘導(dǎo)，采用液體培養(yǎng)基，第一次接種3天后即更換培養(yǎng)基，以后每7天更換1次培養(yǎng)基，90r/min，光照時間12h/d，3000lx，溫度為25℃。所述類原球莖固體誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的培養(yǎng)條件為：3000lx，光照時間12h/d，溫度為25℃。本專利技術(shù)的有益效果是，為了解決資源稀缺問題，有必要建立其快速繁殖的最優(yōu)體系。因此本申請以浙江金線蓮為材料，探討不同植物激素配比對類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的影響，建立植株快速繁殖的最優(yōu)體系，為浙江金線蓮的擴大培養(yǎng)打下基礎(chǔ)，也為今后對浙江金線蓮成分等方面的研究及開發(fā)利用提供條件。同時研究結(jié)果對解決金線蓮基原植物資源保護(hù)與合理利用之間的矛盾具有一定的指導(dǎo)意義。附圖說明下面結(jié)合附圖和實施例對本專利技術(shù)進(jìn)一步說明。圖1是浙江金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)圖；圖2是浙江金線蓮類原球莖的增殖圖；圖3是浙江金線蓮類原球莖分化圖；其中A部分：分化培養(yǎng)10d；B部分：分化培養(yǎng)60d；圖4是60d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，其中A部分：4號培養(yǎng)基；B部分：7號培養(yǎng)基；圖5是120d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，其中A部分：4號培養(yǎng)基，B部分：7號培養(yǎng)基；圖6是180d后浙江金線蓮的生根培養(yǎng)情況圖，其中A部分：4號培養(yǎng)基，B部分：7號培養(yǎng)基。具體實施方式一、材料與方法1.1材料浙江金線蓮（ZJJ）組培苗由同濟(jì)大學(xué)麗水中藥研究院資源植物實驗室提供。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基的配制類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，pH5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中額外添加10%香蕉泥。所有培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20min，冷卻備用。1.2.2類原球莖的誘導(dǎo)液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。選取TDZ和NAA各0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L3種濃度進(jìn)行實驗。取生長健康的無菌苗，在超凈工作臺上將其葉片從柄部切除，氣生根從基部切除，將莖切成含2-4個節(jié)的莖段，隨機接種到各組培養(yǎng)基中，每組4瓶，每瓶接種10個，第一次接種3d后即更換培養(yǎng)基，以后每7d更換1次培養(yǎng)基，接種31d后統(tǒng)計誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計算其誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù)）×100%。固體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。選取TDZ0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、NAA0.2mg/L、0.4mg/L和6-BA2.0mg/L共5種濃度配比組合進(jìn)行實驗。莖段處理與3.2.2.1相同，隨機接種到各組培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶7個-8個，每7d更換1次培養(yǎng)基，接種30d后統(tǒng)計誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計算其誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)效率。誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù)）×100%；誘導(dǎo)效率=（誘導(dǎo)出的類原球莖個數(shù)/接種莖段數(shù)）×100%1.2.3類原球莖的增殖選取稀效唑0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，6-BA1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L和NAA0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L各3個濃度進(jìn)行實驗。將誘導(dǎo)出的帶類原球莖的莖段隨機接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種10個-15個，60d統(tǒng)計結(jié)果，取平均值計算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=（增殖出的類原球莖個數(shù)/接種莖段數(shù)）×100%。1.2.4類原球莖的分化選取6-BA0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L和NAA0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L各3種濃度進(jìn)行實驗。將增殖培養(yǎng)后的類原球莖切割成團(tuán)，隨機接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種5個類原球莖團(tuán)，培養(yǎng)60d統(tǒng)計分化情況，取平均值計算分化率。分化率=（分化的類原球莖數(shù)/接種類原球莖數(shù)）×100%。1.2.5生根培養(yǎng)選取IBA和NAA各0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L3種濃度進(jìn)行實驗。將分化培養(yǎng)得到的幼嫩小苗（約2.0cm）隨機接入生根培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶接種7個-8個幼嫩小苗，每培養(yǎng)60d統(tǒng)計生根情況，取平均值計算生根率。生根率=（生根幼嫩小苗數(shù)/接種幼嫩小苗數(shù)）×100%。1.2.6培養(yǎng)條件類原球莖液體誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為：90r/min，光照時間12h/d，3000lx，25℃；類原球莖固體誘導(dǎo)、增殖、分化及生根的培養(yǎng)條件為：3000lx，光照時間12h/d，溫度為25℃。二、結(jié)果本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法，其特征是：包括類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根步驟，其中，類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根以1/2?MS為基本培養(yǎng)基，加入植物生長調(diào)節(jié)劑，pH?5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中添加質(zhì)量含量10%香蕉泥；１）類原球莖誘導(dǎo)：采用液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中含?TDZ?0.6?mg/L?+?NAA?0.4?mg/L；固體培養(yǎng)基含TDZ?0.6?mg/L?+?NAA?0.2?mg/L?+?6?BA?2.0?mg/L；2）類原球莖增殖：增值培養(yǎng)基中含稀效唑1.5?mg/L?+?6?BA?1.0?mg/L?+?NAA?0.2?mg/L，其中稀效唑是類原球莖增殖的主要因子；3）類原球莖分化：對類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)，10天類原球莖球體頂部開始突起變尖，變綠，60?天后可分化成帶有莖節(jié)、葉片及幼小毛狀根的小苗，分化培養(yǎng)基中含6?BA?0.5?mg/L?+?NAA?0.1?mg/L；4）植株生根：分化的幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10?d后開始有根長出，生根培養(yǎng)基中含?NAA?1.0?mg/L?+?IBA?1.0?mg/L。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種浙江金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立方法，其特征是：包括類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化及生根步驟，其中，類原球莖的誘導(dǎo)、增殖及分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入植物生長調(diào)節(jié)劑，pH5.8，液體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖質(zhì)量百分比濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中添加質(zhì)量含量10%香蕉泥；１）類原球莖誘導(dǎo)：采用液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中含TDZ0.6mg/L+NAA0.4mg/L；固體培養(yǎng)基含TDZ0.6mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L；2）類原球莖增殖：增值培養(yǎng)基中含稀效唑1.5mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，其中稀效唑是類原球莖增殖的主要因子；3）類原球莖分化：對類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)，10天類原球莖球體頂部開始突起變尖，變綠，...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳常理，金關(guān)榮，駱霞虹，唐楠楠，余楊，李珊，程舟，朱關(guān)林，
申請(專利權(quán))人：浙江省蕭山棉麻研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江,33