嵌合蛋白質的表型篩選制造技術

一方面，本發明專利技術涉及篩選編碼不同人工嵌合蛋白質的核酸文庫以鑒定改變細胞或生物體表型特性的嵌合蛋白質。所述嵌合蛋白質可不通過特定靶基因或通路的先驗知識而鑒定。一些嵌合蛋白質包括多個鋅指結構域并可以誘導，例如，耐熱性，溶劑耐受性，改變的細胞生長，胰島素產生，分化和藥物抗性。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

技術介紹
大多數基因在轉錄水平上受結合于基因內、典型地是啟動子或增強子區域內的特異DNA位點的多肽轉錄因子調控。這些蛋白質激活或阻抑RNA聚合酶在啟動子上的轉錄起始，因而調控靶基因的表達。許多轉錄因子，無論激活子還是阻抑子，結構上均含有具有例如DNA結合，二聚體化，或與轉錄機制相互作用等特殊功能的獨特結構域。轉錄因子的DNA結合部分本身可以由和DNA接觸的單獨結構域組成。許多DNA結合結構域，包括鋅指結構域，同源結構域，和螺旋-轉角-螺旋結構域的三維結構已經被NMR和X一射線晶體學數據確定。效應子結構域例如激活結構域或阻抑結構域在轉移到異源轉錄因子的DNA結合結構域時保留了其功能(Brent和Ptashne，(1985)Cell 43729-36；Dawson等，(1995)Mol.Cell Biol.156923-31)?？梢援a生鋅指結構域的嵌合體的人工轉錄因子。例如，WO 01/60970(Kim等)描述了確定鋅指結構域的特異性和構建識別特異靶位點的人工轉錄因子的方法。一個關于人工轉錄因子的申請是去改變特異靶基因的表達。鑒別靶基因中調控區的靶位點，并對人工轉錄因子進行工程化以識別一個或多個所述的靶位點。當這樣的人工轉錄因子被導入細胞后，他們可以結合相應的靶位點來調節轉錄。這樣控制靶基因表達的策略有時被稱為鑒定轉錄因子的“靶驅動(target-driven)”方法。
技術實現思路
一方面，本專利技術描述了一種方法，其包括(1)提供了一種細胞文庫，該文庫包含多種細胞，每種細胞均具有表達一種人工嵌合多肽的異源核酸，該多肽包含第一和第二結合結構域，其中第一和第二結合結構域互相異源，并且所述多種細胞中每個成員的第一和第二結合結構域與其他成員是互異的；和(2)鑒別文庫中與參照細胞相比發生特性(trait)改變的細胞。結合結構域可以是，例如，獨立折疊組件(module)，例如鋅指結構域。在許多實施方式中，結合結構域是DNA結合結構域。典型的，參照細胞是不含有文庫中的核酸或是含有對照核酸的細胞。參照細胞可以是產生細胞文庫的親代細胞或其衍生細胞。特性可以是任何可探測的表型，例如可被觀察到的，選擇的，推斷的和/或量化的表型。此處使用的嵌合蛋白質包含至少兩個互為異源的結合結構域。這兩個結合結構域可以來自不同的天然產生的蛋白質。這兩個區域也可以來自相同的天然產生的蛋白質，但是與相應的天然產生的蛋白質相比，它們在嵌合蛋白質中位于不同的構型中。在許多實施方式中，細胞不含有報道基因。換言之，細胞不通過有關由于嵌合多肽的表達使其調控發生改變的靶基因的先驗信息而進行篩選。另外，細胞可以含有報道基因作為與特性有關或無關的附加的指示標記。同樣，篩選前，可以獲知一個或多個靶基因的信息。在另一實施方式中，特性是產生一個化合物(例如天然或人工化合物)。該化合物可以是抗生素，抗增生藥物，止痛劑，蛋白質等等。在另一實施方式中，特性是對環境條件，例如重金屬，鹽度，環境毒素，生物毒素，病原體，寄生蟲，其它環境極限條件(例如干燥，熱，冷)等等的抗性。在一相關的實施方式中，特性是應激抗性(例如，對熱，冷，極端pH，化學藥品，如氨，藥物，滲透壓，和離子輻射)。在另一實施方式中，特性是藥物抗性。特性的改變可以是雙向的，例如敏感性或增強的抗性。在另一實施方式中，細胞是植物，動物(例如哺乳動物)，真菌，或細菌細胞。對哺乳動物而言，特性可以是細胞增殖，細胞因子、激素或信號分子的產生，細胞信號通路的激活，生理通路(例如葡萄糖動態平衡，代謝，肥胖)的激活。DNA結合結構域可以是，例如，鋅指結構域。典型的，文庫中核酸的第一個鋅指結構域變化多樣，文庫中核酸的第二個鋅指結構域也變化繁多。核酸還可以表達至少一個第三DNA結合結構域，例如第三鋅指結構域。每個表達的多肽的鋅指結構域可以與不同的天然產生的蛋白質的鋅指結構域相同，或者與天然產生的蛋白質不同，例如在DNA接觸位置的突變體。天然產生的蛋白質可以是任何真核鋅指蛋白質例如，真菌(例如酵母)，植物，或動物蛋白質(例如哺乳動物蛋白質，例如人或鼠蛋白質)。每種多肽可以還包含第三，第四，第五，和/或第六個鋅指結構域。每個鋅指結構域可以是哺乳動物的，例如人的鋅指結構域。任選地，所述多種細胞的核酸編碼足夠數目的不同的鋅指結構域以識別至少10，20，30，40，或50個不同的3堿基對的DNA位點。在一個實施方式中，核酸編碼了足夠數目的不同的鋅指結構域以識別不超過30，20，10，或5個不同的3堿基對的DNA位點。表達自細胞文庫的核酸的多肽也可以包括功能性轉錄調控結構域，例如轉錄激活、阻抑結構域甲基化結構域，乙?；Y構域，或去乙?；Y構域。而且許多嵌合多肽沒有融合到特殊的轉錄調節結構域中時也是有功能的。編碼多肽的核酸可以是可操縱地連接組成性或可誘導的啟動子。該方法可進一步包含從鑒定的細胞中分離核酸。該核酸可被測序。核酸編碼的多肽可被分離。該方法還可包含鑒定多肽特異識別的核酸結合位點。結合位點可被鑒定，例如通過對序列數據庫，特別是調控序列數據庫進行計算機字串搜索(string search)或分布圖搜索(profile search)，或通過體外選擇結合多肽的核酸(例如SELEX)?？煞治龊怂嵝蛄械挠嬎銠C數據庫以確定鑒定的核酸結合位點相似于鑒定的結合位點的出現情況。該方法還可包含分析鑒定的細胞中一或多個內源基因的表達或一或多個內源表達的多肽的水平/活性，例如使用mRNA檢測(mRNAprofiling)(例如使用微陣列分析)，2-D凝膠電泳，蛋白質配體(例如抗體)陣列，和/或質譜法。并且，單一或小數目的基因或蛋白質也可被檢測。在另一實施方式中，比較表達受鑒定的嵌合多肽表達改變的基因的調控區來鑒定可以決定因嵌合多肽的表達直接或間接導致的協調調控的候選位點。該方法還可包括培養細胞以產生可改變的特性。例如，如果改變的特性是增加產生代謝物，該方法可包括培養細胞以產生代謝物。該細胞可以來自于文庫，或者是導入了編碼嵌合多肽核酸的細胞。嵌合多肽的表達可被調節，例如通過可誘導的啟動子，以便可細微地區分特性，或者與另一個條件啟動子區分(例如細胞類型特異啟動子)。含有編碼嵌合多肽核酸的細胞可被導入生物體(例如離體處理)，或用于產生轉基因生物。在一實施方式中，至少一些文庫成員編碼了具有不同調控結構域的蛋白質。例如，一些文庫成員可以包括激活結構域，而其它成員包含抑制結構域。例如，在某種情況下文庫中DNA結合結構域的特定組合可表示為與激活結構域融合，在另一種情況下，與阻抑結構域融合。在另一實施方式中，一些文庫成員包含激活結構域，然而其它不含有調控結構域。以下是一些示范表型擴增干細胞群(例如造血干細胞，神經干細胞，表皮干細胞，或臍帶血干細胞)和其它在體外擴增能力有限的細胞；抑制干細胞的分化；細胞(例如分化細胞或干細胞)的多能性增加；改變的應激抗性(例如對環境條件如熱，冷，極端pH，化學試劑如細胞培養中產生的氨，藥物，鹽(滲透壓)，離子輻射等抗性增加或降低)；對離子輻射或毒性試劑(例如抗腫瘤藥物細胞)敏感性增加，例如腫瘤細胞中敏感性升高；支持病毒感染/復制(例如丙型肝炎病毒的復制)；抗病原體，例如病毒，細菌，或原生生物的能力；細胞內RNAi效率的增加；轉化效率的增加本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種修飾的細胞，其包含編碼人工轉錄因子的異源核酸，該人工轉錄因子使得所述修飾的細胞相對于與修飾的細胞基本相同但缺少所述異源核酸和人工轉錄因子的參照細胞具有應激抗性。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：金晉秀，樸卿順，李東起，薛媛基，李鎬琳，李成一，梁效榮，李良順，張永純，
申請(專利權)人：圖爾金株式會社，
類型：發明
國別省市：KR[韓國]