能夠表達結構HCV抗原的重組MVA制造技術

本發明專利技術涉及重組ＭＶＡ，它能夠表達結構ＨＣＶ抗原、所述結構抗原的功能性部分或所述結構抗原的表位。此外，本發明專利技術尤其描述了一種以疫苗形式存在的藥物組合物，和本發明專利技術的重組ＭＶＡ，包含本發明專利技術重組ＭＶＡ的真核細胞，以及該重組ＭＶＡ的不同應用，如，用于制備重組結構蛋白、用于制備藥物組合物，該藥物組合物特別適用于治療和預防ＨＩＶ感染以及由ＨＩＶ引起的疾病。本發明專利技術進一步涉及制備重組ＭＶＡ的方法，以及制備由所述的重組ＭＶＡ和重組ＭＶＡ的ＤＮＡ或ＲＮＡ編碼的重組結構ＨＣＶ多肽的方法。（*該技術在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及重組MVA，它能夠表達結構HCV抗原、所述結構抗原的功能性部分或所述結構抗原的表位。此外，本專利技術尤其描述了一種以疫苗形式存在的藥物組合物，和本專利技術的重組MVA，包含本專利技術重組MVA的真核細胞，以及該重組MVA的不同應用，如，用于制備重組結構蛋白、用于制備藥物組合物，該藥物組合物特別適用于治療和預防HIV感染以及由HIV引起的疾?。灰约爸苽浔緦＠夹g的重組MVA、由所述的重組MVA和重組MVA的DNA或RNA編碼的重組結構HCV多肽的方法。
技術介紹
丙型肝炎病毒(HCV)其是一種屬于Flaviviridaae家族的正鏈RNA病毒。它是人群中由于輸血引發的非A-、非B-型肝炎的主要介質(8，35)。超過70％的感染病人可能發展為慢性肝炎，并進一步發展為肝硬化和肝細胞腫瘤(30，53)。目前的治療方法很有限(39，40，31，24，13)。已經在疫苗的研發上進行了很多努力，并且取得了一些令人鼓舞的成績(9，41，22，25)，但迄今為止還沒得到有效的和/或治療的疫苗。結構HCV蛋白，例如病毒包衣蛋白核(viral capside protein nucleus)、以及外殼糖蛋白(envelope glycoprotein)E1和E2是有希望的疫苗靶位在不同的HCV基因型和亞型中核心抗原高度保守(6)。在諸如Rabies病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒等不同的模型中，核殼體(nucleocapsid)等內部抗原(internal antigen)都與保護免疫反應相關聯。采用下述的不同方法可誘導并檢測HCV核特異性的抗體和CTL反應(22，23)。相比之下，核心蛋白似乎具有許多調節功能，這些功能與宿主細胞的凋亡、轉錄、轉化和免疫呈遞等的調節相關(43，4)。采用重組E1和E2蛋白免疫黑猩猩能誘導對同源蛋白的免疫保護，推測這是通過誘導中和抗體來起作用的(9)。根據多篇報道，存在于E2的N-末端的高度可變區(HVR)可以是重要的中和位點(20，34，67，68)。由于缺少合適的動物模型，從而使得針對HCV的宿主免疫反應以及對疫苗保護的評價等研究變得很復雜。由于缺少有效的體外細胞培養系統來進行HCV擴增，并且在感染的肝組織或血液中HCV顆粒的數量很少，因此阻礙了對傳統的諸如減毒或滅活病毒疫苗的形成及評價?；诨钶d體病毒表達抗原編碼序列的原理，在HCV疫苗的開發中采用載體疫苗是一種新的替代途徑。本專利技術的目的在于提供一種適于人和動物預防及治療HCV感染的新的制劑，該制劑能夠避免上述的缺點。根據本專利技術，該目的是通過重組MVA來完成的，所述MVA通過修飾能夠表達結構HCV抗原、結構HCV抗原的功能性部分和/或所述HCV結構抗原的表位，優選表面表位。本專利技術的優選實施例可參考下述說明書以及所述的權利要求。根據本專利技術，具有編碼結構HCV抗原、結構HCV抗原功能性部分或所述結構HCV抗原表位的DNA序列的重組MVA非常適用于制備疫苗。尤其令人驚奇的是，HCV核心抗原的制備或共同制備(co-production)并不影響疫苗的免疫原性。準確地，出版物(19)顯示，在受感染的或接種疫苗的宿主中，免疫反應通過一種特別的方式受到抑制，即，通過牛痘病毒的復制來抑制。因此，可以設想，當使用MVA作為制備結構HCV抗原的載體時，也會發生這種抑制。然而文中顯示，令人預料不到的是，當使用MVA載體時，所述免疫抑制再次得到補償。所報道的這一令人驚奇的實驗結果為開發新疫苗提供了良好的基礎，尤其是在將HCV抗原作為疫苗抗原提供了基礎。本專利技術所用的病毒載體是基于改良的安卡拉牛痘病毒(vaccinia virusAnkara，MVA)，該病毒是一種高度減毒(attenuated)的牛痘病毒株，已證實該病毒在臨床應用是很安全的，這很可能是由于它的復制缺陷(42，45，60，50)。重組MVA(rMVA)用作疫苗已經證實能刺激T-細胞和針對不同異種抗原的抗體反應，并且在人類的多種感染性疾病(包括流感、AIDS、麻疹、以及瘧疾)的動物模型實驗中都具有保護作用(61，3，27，52，15，59，1)。盡管實質上已經知道重組MVA在制備疫苗中的應用，但是疫苗與結構HCV抗原，也即HCV的核心抗原以及E1和E2的組合應用現今還少有應用。實際上HCV的結構抗原是已知的。其包括外殼蛋白核心、包膜糖蛋白E1和包膜糖蛋白E2。已知為制備疫苗不必完全表達HCV的結構抗原。實驗人員也能夠根據特定的實驗步驟以及所需的結果而僅表達結構抗原的一部分，尤其是HCV結構抗原的功能性部分或者表位。例如，功能性部分包括結構HCV抗原的免疫原性部分。其實例包括C-末端核心蛋白區域(HCV多蛋白質的127-190位氨基酸)、HCV多蛋白質的220-371位氨基酸的E1蛋白區域、以及包含糖蛋白E2的N-末端的高度可變區的27個氨基酸(Rehermann &Chisari 2000，Curr Top.Microbiol.Immunol 242299-325，Penin et al.2001，J Virol 755703-5710)。結構抗原的功能性部分包括例如HCV核心蛋白的124個N-末端氨基酸(Kunkel et al.J.Virol 752119-2129，2001)，它足以用于病毒樣的核衣殼顆粒的裝配；以及跨膜結構域TMD-E1的350-370位氨基酸或者TMD-E2的717-740位氨基酸，它對包膜蛋白E1和E2的異質二聚化(heterodimerisation)是非常必要的(Op de Beeck et al.2000，J.Biol.Chem.27531428-31437)；或者糖蛋白的可分泌型，它能夠穿過內質網。優選地，這是通過缺失或其它突變來改變E1或E2的跨膜結構域來完成的，從而使得蛋白質不再保留在膜上(Michalak et al.1997，J Gen Virol 782299-2306)。結構HCV抗原的表位是已知的。這些表位包括諸如MHC-I限制性T-細胞核心氨基酸2-10，核心氨基酸35-44，核心氨基酸41-49，核心氨基酸85-98，核心氨基酸132-140，核心氨基酸167-176，核心氨基酸178-187，核心氨基酸181-190，E1氨基酸220-227，E1氨基酸233-242，E1氨基酸363-371，E2氨基酸401-411，E2氨基酸489-496，E2氨基酸521-628或者E2氨基酸725-733(Rehermann & Chisari 2000，Curr Top Microbiol Immunol242299-325)。進一步的例子包括E1表位氨基酸312-326。結構HCV抗原的表位還可以利用已知的技術來確定，例如在Koziel et al 1995，J.ClinInvest 962311-2321中所述。在本專利技術的一個優選實施方案中，重組MVA包括編碼E1和E2的DNA序列。特別有利的是可以采用E1抗原與E2抗原的截短形式(truncated form)的組合，從而使得兩種抗原能夠共同制備。“截短”表示E2糖蛋白的親脂性部分缺失。本實施方案已經表明，與表達E1抗原和全部E2蛋白的重組MVA疫苗接種本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組ＭＶＡ，其特征在于，它包含編碼ＨＣＶ結構抗原或者編碼ＨＣＶ結構抗原的功能性部分或表位的ＤＮＡ序列。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：格爾德祖特爾，福爾克爾艾爾弗勒，卡羅琳施泰布，王圓，李光弟，朱立新，
申請(專利權)人：GSF環境及健康研究中心有限公司，
類型：發明
國別省市：DE[德國]