人促生長因子C的改進生產方法技術

一種用來選擇ＤＮＡ片段的方法，轉化有這些ＤＮＡ片段的宿主可使多肽生產獲得最佳效果．這些ＤＮＡ片段可儲存有各種人和動物蛋白質的密碼，并可使這些蛋白質在宿主細胞中表現出高效表達．在本發明專利技術的優選實施方案中，選擇出具有生產人ＳＭＣ最佳效果的ＤＮＡ片段，用來表達這種生長促進因子．（*該技術在2006年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種確定DNA片段的方法，該DNA片斷對轉化這些DNA片段的宿主生產所需蛋白質或多肽為最適。本專利技術特別涉及到確定對生產人促生長因子C(“SMC”)為最適的并經過修飾的DNA片段。本專利技術還涉及到以這些DNA片段為特征的重組DNA分子和宿主以及使用這些DNA片段、重組DNA分子和宿主來提高人促生長因子C或來源于真核和原核生物的其它蛋白質的生產方法。人促生長因子C是一種類似于胰島素的生長因子，在垂體分泌生長激素后，它是激發組織生長的關鍵蛋白質。人促生長因子C的氨基酸順序是由E.Rinderknecht和R.E.Humble在J.Biol.Chem.，253，pp.2769-76(1978)上報道。它是由一條含有70個氨基酸的單鏈多肽經3個二硫鍵聯結而成。計算出的分子量為7649。促生長因子C的結構與胰島素前體很相似，例如，促生長因子C第1-29個氨基酸相當于胰島素B鏈，第42-62個氨基酸相當于胰島素A鏈。然而，促生長因子C中的聯結鏈卻與胰島素前體的C肽鏈不相似，促生長因子C還有1個在胰島素前體中不存在的位于C端的8肽。促生長因子C在體外表現出強烈的生長促進作用，如它能促進DNA、RNA、蛋白質和糖蛋白的合成〔E.Rinderknecht and R.E.Humble，Proc.Natl.Acad.Sci USA，73，pp.2365-69(1976);B.Morell and E.R.Froesch，Eur.J.Clin.Invest.，3，pp.119-123(1973);E.R.Froesch et al.，Adv.Mental.Disord.，8，pp.211-35(1975);A.E.Zingg and E.R.Froesch，Diabetologia，9，pp.472-76(1973);E.R.Froesch et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，pp.2904-08(1976)〕。它還能促進鳥氨酸脫羧酶和細胞增殖〔B.Morrel and E.R.Froesch，supra;G.K.Haselbacher and R.E.Humble，J.Cell.Physiol.，88，pp.239-46(1976)〕。在生物體內，促生長因子C有促進因垂體切除而造成的生長激素缺乏癥的老鼠生長的作用。〔E.Schoenle.et al.，Nature.296，pp.252-53(1982)〕象生長激素一樣，促生長因子C也有一定程度的物種特異性。然而，從一種生物提出的促生長因子C對在進化地位較低的種類可以具有生物學活性，例如，人們相信人促生長因子C在促進牛、豬和雞的生長中有一定的作用。對實驗動物，促生長因子C表現出來的促進生長作用與天然人生長激素的作用相同。但是，人們認為促生長因子C優于人生長激素，因為促生長因子C是生長反應中的中樞調節因子。因此，同生長激素相比，促生長因子C是生長的更加直接的調節因子。促生長因子C除了可以治療某些形式的生長失調如侏儒癥、肌肉萎縮外，還可用于刺激特殊部位的組織生長，如傷口愈合、組織損傷和骨折的愈合。然而，由于促生長因子C只能從人類血液中提取，得到的數量很少，它作為組織生長促進因子在醫學上的可能應用受到很大限制。因而，需要用其它方法來制取具有商業和醫用價值的足夠多的促生長因子C。一種方法是利用重組DNA技術，將編碼促生長因子C的DNA片段轉化到宿主中，由宿主來生產促生長因子C。然而，由于轉化后的各種大腸桿菌宿主的促生長因子C表達產量很低，從經濟上考慮無法進行商業生產。本專利技術對上述問題的解決方法是用一種方法來確定這樣的DNA片段，該片段對轉化有這些DNA片段的宿主生產促生長因子C或其它所需原核、真核生物蛋白質或多肽為最適。經過這個方法選擇出來的經過修飾的DNA片段編碼這些蛋白質的表達一具體在本專利技術優選實施方案為促生長因子C，并且可在各種宿主中進行有效的高水平生產。因此，借助于本專利技術的方法，人類有可能首次得到具有促生長因子C的促進和調節生長作用的多肽，并且其數量足以供應醫學應用所需。以下的描述將說明，按本專利技術的優選實施方案，本專利技術的新DNA片段和重組DNA分子能夠在合適的宿主內生產出大量的促生長因子C或類似于它的多肽。由此獲得的多肽在人、牛、豬和雞體內具有廣泛的促進和調節生長的作用。還可看到，本專利技術的一個基本要求是計設一個方法來確定在促生長因子C、其它所需原核或真核生物蛋白及多肽的生產中具有最佳效果的DNA片段。另一基本要求是關于能夠增加這些蛋白質特別是促生長因子C或其類似多肽產量的各種新DNA片段、重組DNA分子和宿主。大概地講，本專利技術之對在用編碼所需蛋白或多肽的DNA片段所轉化的宿中生產所需真核或原核生物蛋白或多肽的改進方法包括下列步驟將編碼一種易分析蛋白質或多肽的DNA片段之N端的一部分，用編碼所需原核或真核生物蛋白質或多肽N端一部分的DNA片段的一系列降解產物來取代;使得到的一系列雜種DNA片段與合適的表達控制片段聯結，在適宜的宿主內表達;選擇出使易分析蛋白質或多肽生產達到最佳效果的雜種DNA片段，并且應用那些所選擇出的雜種DNA序列的N末端部分，其在所需多肽或蛋白的表達中編碼所需多肽或蛋白的N末端部分。該方法使所需蛋白或多肽的生產達到最適。圖1表明了如何制備編碼f-Met-SMC(甲酰甲硫氨酸促生長因子C，以下用SMC代表促生長因子C)的合成DNA片段和如何制備pLc24-muSMCori質粒的簡要輪廓，pLc24muSMCori′質粒含有的該DNA片段位于來自mu噬菌體和PL啟動子的片段下游。圖2表示兩個片段SMC A和SMC B的合成核苷酸順序(都是雙鏈)，這兩個片段在本專利技術的一個方法實例中用于制備編碼f-Met-SMC的DNA片段。圖2還表明了片段SMC A和SMC B的氨基酸順序和1-11、X、Y和Z等用以制備這兩個片段所需的各個多聚核苷酸順序。圖3表示一個制備質粒pUCmuSMC Aori′，pUCmuSMC A1-18和pUCmuSMC1-18的簡單輪廓。圖3中部表示的512次降解合成連接子的順序中，“N”代表所有4種可能的堿基，“P”代表嘌呤，“Y”代表“嘧啶”。下面，對本專利技術的詳細說明將有助于對本專利技術的充分理解。在說明中，使用了以下術語核苷酸DNA或RNA的單位，由糖分子(戊糖)、磷酸分子和-含氮雜環堿基組成。堿基與糖苷碳(戊糖的1′碳)相連，形成的結合物叫核苷。每一核苷酸的性質取決于其所含有的堿基。DNA中的4個堿基為腺嘌呤(“A”)、鳥嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)，RNA中的4個堿基為A.G.C和尿嘧啶(“U”)。DNA片段 核苷酸的線性排列，各核苷酸之間是通過磷酸二酯鍵將相鄰二個戊糖分子的3′碳和5′碳聯結而成。密碼子 含有三個核苷酸的DNA片段(三聯體)，通過RNA編碼一個氨基酸，轉譯起始信號或轉譯終止信號。基因 一段DNA片段，它通過它的模板即mRNA編碼出代表特定多肽的氨基酸序列。轉錄 從基因形成mRNA的過程。轉譯 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
將編碼擬制多肽的ＤＮＡ片段經人工操作與表達控制片段連結后，轉化到宿主中來提高這種多肽生產的方法，該方法包括下述步驟：將編碼一種易分析多肽Ｎ端一部分的ＤＮＡ片段，用編碼擬制多肽Ｎ端一部分的ＤＮＡ片段的一系列降解產物來取代，該取代并不影響易分析多肽的易分析性，使得到的一系列雜種ＤＮＡ片段與合適的表達控制片段經人工操作相連，在宿主內表達；選擇出使易分析多肽產生達到最佳效果的雜種ＤＮＡ片段；選擇出的雜種ＤＮＡ片段儲存有擬制多肽Ｎ端一部分的密碼，將此雜種ＤＮＡ片段的Ｎ端那部分用來表達擬制多肽。

【技術特征摘要】
GB 1985-3-26 8507833而不是用前面的列舉具體例證的方法來限定本發明的涉及范圍。權利要求1.將編碼擬制多肽的DNA片段經人工操作與表達控制片段連結后，轉化到宿主中來提高這種多肽生產的方法，該方法包括下述步驟將編碼一種易分析多肽N端一部分的DNA片段，用編碼擬制多肽N端一部分的DNA片段的一系列降解產物來取代，該取代并不影響易分析多肽的易分析性使得到的一系列雜種DNA片段與合適的表達控制片段經人工操作相連，在宿主內表達；選擇出使易分析多肽產生達到最佳效果的雜種DNA片段；選擇出的雜種DNA片段儲存有擬制多肽N端一部分的密碼，將此雜種DNA片段的N端那部分用來表達擬制多肽。2.根據權項1所述的方法，其特征在于從β-半乳糖苷酶、半乳糖激酶和具有抗藥標志物中來選擇出所述的易分析多肽。3.根據權項1所述的方法，其特征在于，擬制多肽選自動物或人的干擾素、白細胞介素和其它淋巴因子、血液因子、酶、病毒抗原、SMC、生長激素和其它激素及多肽。4.根據權項1所述方法，其特征在于，表達控制片段選自lac系統，trp系統，tac系統，trc系統，λ噬菌體的主要操縱子和啟動子區域，fd外殼蛋白質的控制區域，SV40早期和晚期啟動子，來自多形瘤、腺病毒和猿病毒的啟動子，酵母蛋白質水解酶的啟動子，酵母α-配對因子和酵母酸性磷酸酶的啟動子。5.根據權項1所述的方法，其特征在于所述的宿主選自大腸桿菌各種菌株，假單胞菌屬，桿菌屬，鏈霉菌屬，酵母，其它真菌，動物和植物細胞。6.根據權項1所述的方法，其特征在于所述的DNA片段儲存有類似SMC多肽密碼，并且是從pLC24muSMC1至pLC24muSMC10的DNA插入片段中選擇而來。7.儲存有擬制多肽密碼的DNA片段，此片段是由包括下列步驟的方法制備而來將儲存有一種易分析多肽密碼的DNA片段N端的一部分用儲存有擬制多肽N端一部分的密碼的DNA片段的一系列降解產物來取代，該取代基本不影響分析蛋白質的易分析性;使得到的一系列雜種DNA片段與合適的表達控制片段經人工操作相連，在宿主內表達;選擇出使易分析多肽產生達到最佳效果的雜種DNA片段;把儲存有擬制蛋白質密碼的D...

【專利技術屬性】
技術研發人員：加里N布爾，納吉斯瓦拉羅莫瓦，
申請(專利權)人：拜奧根公司，
類型：發明
國別省市：NL[荷蘭]