檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器和方法技術

本發明專利技術提供了一種利用特定堿基位點上標記電化學標記物(例如亞甲基藍)的核酸適配體修飾的電極構建的電化學傳感器和檢測方法，可以實現快速靈敏檢測赭曲霉毒素A。相應的核酸適配體利用末端標記的硫醇，核酸適配體被固定到金電極表面。通過考察一系列標記位點，優化出可使傳感器產生靈敏信號變化的標記位點。通過測定電化學標記物的電化學信號變化可以實現對赭曲霉毒素A的檢測。這種傳感器操作簡單、響應迅速、具有高靈敏度、而且可再生重復使用、具有高穩定性。利用制備的電化學傳感器可以實現檢測30pM赭曲霉毒素A，并可以用于復雜樣品基質中赭曲霉毒素A的檢測。

Electrochemical sensor and method for detection of ochratoxin A

【技術實現步驟摘要】
檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器和方法
本專利技術屬于電化學分析
，具體涉及一種檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器和方法。
技術介紹
赭曲霉毒素A(OchratoxinA，簡稱OTA)是由赭曲霉(Aspergillus)、疣孢青霉(Pmicilium)等真菌產生的次級代謝產物。赭曲霉毒素A容易對谷物(玉米和小麥等)、堅果、咖啡、葡萄等農產品和食物，以及加工后的食品中造成污染。動物和人類食用OTA污染后的食物后，OTA對動物和人類造成健康危害。赭曲霉毒素A可產生腎毒性、肝毒性、免疫毒性、致癌性等。世界癌癥研究組織將OTA定為2B類致癌物。赭曲霉毒素A在很多農產品和食品中的含量需要嚴格控制，各個國家和地區都制定了嚴格的限量標準。赭曲霉毒素A在產品中超標的事件也屢有報道。因此，對赭曲霉毒素A進行定量檢測在生產生活、食品安全和環境健康等領域中具有重要需求。色譜分析、質譜分析法等具有準確性高、選擇性好等優勢，但往往需要昂貴的儀器、繁瑣的分析步驟、專業技術人員、檢測時間長、檢測費用高，并不利于在現場、快速、低成本檢測赭曲霉毒素A。電化學傳感器具有成本低、靈敏、操作簡單等優點，與光學檢測傳感方法相比，電化學檢測不容易受有色物質、熒光物質或渾濁溶液的干擾。然而，目前已有報道的一些檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器還存在不少局限。一些利用免疫抗體檢測赭曲霉毒素A的傳感器需要采用免疫抗體，免疫抗體制備成本高、穩定性和批間重現性差、而且基于免疫抗體的電化學傳感器電化學信號產生方式比較復雜，在快速檢測方面仍有不足。基于免疫抗體的電化學傳感器的制備也不容易，免疫抗體傳感器儲存過程中抗體容易失活。基于核酸適配體的傳感器結合了核酸適配體的優點，核酸適配體是一種核酸型的親和配體，其可以通過化學合成手段進行制備，容易引入功能團用于標記或固定化，熱穩定性好。目前報道的一些檢測赭曲霉毒素A的核酸適配體電化學傳感器大多采用在核酸適配體末端標記電化學活性基團，電極表面的核酸適配體與赭曲霉毒素A結合后，引起赭曲霉毒素A的電化學活性基團的電化學信號的變化，然而電流信號變化幅度不大，而且一些傳感器檢測靈敏度不高。其他的核酸適配體電化學傳感器需要很復雜的制備過程，需要一些信號放大策略，檢測步驟多，且耗時，而且電化學傳感器不能很好再生重復使用，檢測重現性不好，不容易操作。這些電化學傳感器不能滿足快速靈敏檢測赭曲霉毒素A的需求。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術提出了一種檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器和方法，可以快速、靈敏地分析赭曲霉毒素A。為了達到上述目的，本專利技術采用以下技術方案：一種檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，包括：利用赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極，其中所述赭曲霉毒素A核酸適配體帶有電化學標記物，所述電化學標記物位于所述赭曲霉毒素A核酸適配體的特定堿基上以增強檢測信號。在一些實施方案中，所述赭曲霉毒素A核酸適配體為特異性結合赭曲霉毒素A的DNA序列。在一些實施方案中，所述電化學標記物為亞甲基藍或二茂鐵。在一些實施方案中，所述特定堿基選自A、G、C或T。在一些實施方案中，所述DNA序列包括SEQIDNO：1或由SEQIDNO：1組成，其5’端或3’端利用硫醇分子修飾，所述電化學標記物位于所述序列的第30位的T堿基上，或者所述DNA序列包括在SEQIDNO：1的一端或兩端減少或增加一個或多個堿基的序列，所述電化學標記物位于與SEQIDNO：1的上述T堿基對應的T堿基上。在一些實施方案中，所述電極為金電極或具有金涂層或納米金材料修飾的電極。一種所述電化學傳感器的制備方法，包括：將帶有電化學標記物標記的赭曲霉毒素A核酸適配體固定在電極上。所述電極為金屬電極或非金屬電極，優選為金電極，具體步驟包括：對金電極進行表面處理后浸入含有赭曲霉毒素A核酸適配體的緩沖溶液，靜置0.5-2(例如1小時或1.5小時)小時后利用超純水清洗；將所述金電極浸入含有巰基己醇的緩沖溶液，靜置1-3(例如1.5小時、2小時或2.5小時)小時后利用超純水清洗。在一些實施例中，所述表面處理包括將所述金電極打磨(例如利用0.01-0.1μm的氧化鋁粉打磨)后使用超純水超聲清洗，再進行電化學清洗。在一些實施例中，所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液，pH為7-8(例如7.2、7.5或7.8)，所述核酸適配體的濃度為100-1000nM(例如100nM、300nM、500nM或800nM)，巰基己醇的濃度為1-5mM(例如2mM、3mM或4mM)。一種利用所述電化學傳感器檢測赭曲霉毒素A的方法，包括將所述電極在含有待測樣品的反應緩沖溶液中溫育2-5分鐘后，采用電化學法進行測定。在一些實施例中，所述反應緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液，其含有Ca2+或Mg2+(例如CaCl2或MgCl2，其濃度為1-100mM，優選為10-30mM)中的一種或兩種和Na+或K+(例如NaCl或KCl，其為濃度為50-500mM，優選為100-300mM)中的一種或兩種，pH為7-8(例如7.2、7.5或7.8)。在一些實施方案中，所述電化學法選自方波伏安法、差分脈沖伏安法或交流伏安法。在一些實施方案中，所述電化學法選自方波伏安法，在所述電化學法中，電壓范圍為0～-0.5V，采樣間隔1mV，幅度25mV，頻率250Hz。與現有技術相比，本專利技術所構建的核酸適配體電化學傳感器制備容易、傳感器響應迅速、檢測操作簡單只需要將電化學傳感器置于樣品溶液中就可進行測定，無需額外的試劑。所構建的電化學傳感器具有高靈敏度，檢測限達到30pM，檢測范圍寬涵蓋了幾個數量級。而且，這種電化學傳感器容易再生，可重復使用。這種核酸適配體電化學傳感器具有很好的穩定性。這種傳感器具有高選擇性。附圖說明圖1用于考察序列中不同堿基T標記MB的核酸適配體對應的電化學傳感器針對OTA的信號響應；圖2為本專利技術實施例中核酸適配體電化學傳感器檢測OTA的典型方波伏安檢測曲線；圖3為電化學傳感器檢測OTA時，方波伏安分析中MB峰電流與OTA濃度關系；圖4用于說明本專利技術實施例中電化學傳感器的選擇性；圖5為在稀釋的啤酒中檢測OTA的結果；圖6為在稀釋的牛奶樣品中檢測OTA的結果。具體實施方式為使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本專利技術作進一步的詳細說明。本專利技術利用赭曲霉毒素A的核酸適配體作為親和配體，通過在序列內部特定堿基上標記電化學標記物(例如亞甲基藍(MB))構建了一種操作簡單、可靈敏快速檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器。本專利技術實施例在可識別赭曲霉毒素A的核酸適配體序列的特定堿基(如A、G、C或T堿基)位點上標記上電化學標記物(例如亞甲基藍)電化學活性基團，同時末端標記上硫醇，再將這種核酸適配體修飾固定到金電極表面上。當赭曲霉毒素A與電極表面的核酸適配體結合時，導致核酸適配本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其特征在于，包括：利用赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極，其中所述赭曲霉毒素A核酸適配體帶有電化學標記物，所述電化學標記物位于所述赭曲霉毒素A核酸適配體的特定堿基上以增強檢測信號。/n

【技術特征摘要】
1.一種檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其特征在于，包括：利用赭曲霉毒素A核酸適配體修飾的電極，其中所述赭曲霉毒素A核酸適配體帶有電化學標記物，所述電化學標記物位于所述赭曲霉毒素A核酸適配體的特定堿基上以增強檢測信號。


2.根據權利要求1所述檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其中，所述赭曲霉毒素A核酸適配體為特異性結合赭曲霉毒素A的DNA序列。


3.根據權利要求1所述檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其中，所述電化學標記物為亞甲基藍或二茂鐵。


4.根據權利要求1所述檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其中，所述特定堿基選自A、G、C或T。


5.根據權利要求1所述檢測赭曲霉毒素A的電化學傳感器，其中，所述DNA序列包括SEQIDNO：1或由SEQIDNO：1組成，其5’端或3’端利用硫醇分子修飾，所述電化學標記物位于所述序列的第30位的T堿基上，或者所述DNA序列包括在SEQIDNO：1的一端或兩端減少或增加一個或多個堿基的序列，所述電化學標記物位于與SEQIDNO：1的上述T堿基對應的T堿基上。


6.根據權利要求1所述檢測赭曲霉毒素A的電化學傳...

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙強，王超，
申請(專利權)人：中國科學院生態環境研究中心，
類型：發明
國別省市：北京;11