一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，包括樣品預(yù)處理、樣品提取、濃縮純化、分析檢測。本方法采用甲醇震蕩提取、固相萃取和高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC?MS)來測定蔬菜植物中的咖啡因及其代謝產(chǎn)物。取植物干粉，加入甲醇震蕩提取；合并提取液旋蒸濃縮，通過固相萃取小柱除去雜質(zhì)后，旋蒸、氮吹干后濾膜定容至1mL，待儀器分析；利用HPLC儀器，進(jìn)行梯度洗脫；以四極桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測器來檢測分析蔬菜植物中的咖啡因及其代謝產(chǎn)物。該方法針對(duì)咖啡因這一環(huán)境有機(jī)污染物，對(duì)外源引入咖啡因的蔬菜樣品進(jìn)行測定，建立提取效率好、最大限度去除植物色素干擾、靈敏度高的分析方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法
本專利技術(shù)涉及植物中咖啡因提取和檢測的
，具體涉及一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法。
技術(shù)介紹
藥物和個(gè)人護(hù)理品(PharmaceuticalsandPersonalCareProducts，PPCPs)是一類對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康具有潛在危害的新興污染物，其環(huán)境存在、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和毒理學(xué)等方面的研究引起了環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。咖啡因作為較為常見的PPCPs，在環(huán)境中具有極高的檢出率，在世界各地的自然水環(huán)境和污水中均檢測到咖啡因的存在，其檢測濃度通常達(dá)到ng/L至μg/L的水平。環(huán)境中這些咖啡因污染物的主要來源是污水處理廠，在常規(guī)廢水處理過程中，咖啡因通常不能完全被去除。含有咖啡因的生活廢水經(jīng)污水處理后，可用于農(nóng)業(yè)灌溉，隨后其中的咖啡因及其代謝產(chǎn)物可能進(jìn)入食物鏈，最終給生態(tài)系統(tǒng)和人類健康帶來不利影響。咖啡因是一種中樞神經(jīng)興奮劑，有刺激中樞神經(jīng)的功能，具有成癮性；其作為最常用的精神活性物質(zhì)，當(dāng)達(dá)到平均攝入水平時(shí)，其通常被認(rèn)為對(duì)機(jī)體健康有好處或者說并沒有壞處，然而如今越來越多的研究證據(jù)表明，孕期攝入咖啡因可能會(huì)對(duì)嬰兒健康有害，且世界衛(wèi)生組織也限定了咖啡因的每日攝入量。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單，咖啡因?qū)儆?類致癌物，一旦人體過量使用對(duì)身體健康存在很大的威脅。因此，檢測鑒定蔬菜吸收外源咖啡因及其代謝產(chǎn)物的含量，對(duì)于保障環(huán)境和食品安全具有重要意義。在目前的相關(guān)研究中，咖啡因通常使用超聲提取、固相萃取和液相色譜法分析。現(xiàn)有測定咖啡因的方法基本是通用的PPCPs檢測方法，研究對(duì)象限于水體、土壤、飲料或含咖啡因的植物，沒有提到對(duì)于不含咖啡因植物的咖啡因及其代謝產(chǎn)物的提取分析方法。由于植物基質(zhì)復(fù)雜、影響因素多，特別是含有多糖，色素，有機(jī)酸等雜質(zhì)難以去除。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，改善原有的提取檢測條件，采用震蕩提取、雙柱固相萃取、HPLC-MS檢測的方法，建立提取效率好、最大限度去除植物色素干擾、靈敏度高的分析方法。一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，包括：(1)樣品預(yù)處理；(2)樣品提取；(3)濃縮純化；(4)分析檢測。步驟(1)中，所述的樣品預(yù)處理具體包括：將樣品冷凍干燥至恒重后，用研缽將其研磨均勻，并過50～70目篩。所述的樣品為生長在含咖啡因廢水中的蔬菜樣品，如生長在初始咖啡因濃度為1ppm的培養(yǎng)液中的菜心植株。優(yōu)選地，過60目篩步驟(2)中，所述的樣品提取，具體包括：向預(yù)處理后的樣品中加入Na2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋，再加入甲醇，震蕩提取3～5次，每次1～3h，然后離心，合并上清液，得到樣品提取液。進(jìn)一步優(yōu)選，向預(yù)處理后的樣品中加入100～200mg/LNa2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋0.5min～3min，再加入甲醇，20℃～30℃下150～250rpm震蕩提取3～5次，每次1～3h，然后8000～12000rpm離心5～15min，合并上清液，得到樣品提取液；所述的預(yù)處理后的樣品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比為500mg：1～4mL：10～40mL。最優(yōu)選的，向預(yù)處理后的樣品中加入150mg/LNa2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋1min，再加入甲醇，25℃下200rpm震蕩提取4次，每次2h，然后10000rpm離心10min，合并上清液，得到樣品提取液；所述的預(yù)處理后的樣品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比為500mg：2mL：20mL。步驟(3)中，所述的濃縮純化，具體包括：將樣品提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋蒸時(shí)20℃～40℃水浴加熱；依次用甲醇和去離子水活化固相萃取柱，將兩種小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA組裝到一起，將濃縮液過以上兩種小柱，并用甲醇分次不斷抽真空洗脫；洗脫液合并后旋蒸，然后氮吹濃縮至恰好吹干，用甲醇定容，過濾，保存。所述的氮吹濃縮的干浴溫度為30℃～40℃。最優(yōu)選的，將樣品提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2mL，旋蒸時(shí)30℃水浴加熱；依次用6mL甲醇和去離子水活化固相萃取柱，將兩種小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA(規(guī)格為200mg，6mL)組裝到一起，將2mL濃縮液過以上兩種小柱，并用40mL甲醇分次不斷抽真空洗脫；洗脫液合并后旋蒸至5mL，然后氮吹濃縮(干浴溫度為35℃)至恰好吹干，用甲醇定容至1mL，過0.22μm尼龍針筒過濾器過濾，得到待檢測純品，保存于棕色樣品瓶中，待儀器分析。步驟(4)中，所述的分析檢測，具體包括：利用HPLC-MS/MS進(jìn)行分析檢測；HPLC儀器的檢測條件設(shè)置為：進(jìn)樣體積10～30μL，柱溫30～50℃，流速為0.5～2mL/min，色譜柱為C18液相色譜柱，流動(dòng)相為含體積百分?jǐn)?shù)0.005％～0.02％甲酸的去離子水和含體積百分?jǐn)?shù)0.005％～0.02％甲酸的乙腈，檢測波長為262～282nm。HPLC儀器的流動(dòng)相的洗脫程序的時(shí)間為30～50min，流動(dòng)相的洗脫程序從含體積百分?jǐn)?shù)0.005％～0.02％甲酸的去離子水和含體積百分?jǐn)?shù)0.005％～0.02％甲酸的乙腈體積比95：5至5：95進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)一步優(yōu)選，HPLC儀器的檢測條件設(shè)置為：進(jìn)樣體積20μL，柱溫40℃，流速為1mL/min，色譜柱為XBridgeC18液相色譜柱(5μm×4.6mm×250mm)，流動(dòng)相為含體積百分?jǐn)?shù)0.01％甲酸的去離子水和含體積百分?jǐn)?shù)0.01％甲酸的乙腈，檢測波長為272nm。流動(dòng)相的洗脫程序的時(shí)間為40min，流動(dòng)相的洗脫程序從含體積百分?jǐn)?shù)0.01％甲酸的去離子水與含體積百分?jǐn)?shù)0.01％甲酸的乙腈體積比95：5至5：95進(jìn)行梯度洗脫。MS/MS儀器的檢測條件為：電噴霧電離源(ESI)，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3500V～4500V和60V～70V，干燥氣溫度和流速為200℃～300℃和6L/min～10L/min。最優(yōu)選地，MS/MS儀器的檢測條件為：電噴霧電離源(ESI)，掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為4000V和65V，干燥氣溫度和流速為250℃和8L/min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的有效效益主要體現(xiàn)在：(1)在樣品前處理和提取步驟中，通過優(yōu)化研磨程度、提取液的種類和提取次數(shù)，減少了在樣品處理過程中的損耗，提高了提取效率。(2)蔬菜樣品，特別是葉菜類，其葉綠素含量很高。色素等雜質(zhì)的存在會(huì)對(duì)化合物的分析檢測造成干擾，會(huì)影響儀器的靈敏度和色譜柱的分離效果。本專利技術(shù)在不影響純化效率的前提下，采用兩種固相萃取小柱對(duì)提取樣品進(jìn)行分離純化，有效的減少了蔬菜提取樣品中的有機(jī)酸、色素和金屬離子等雜質(zhì)，最大限度去除了植株色素的干擾。(3)本發(fā)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，包括：/n(1)樣品預(yù)處理；/n(2)樣品提取，具體包括：/n向預(yù)處理后的樣品中加入Na

【技術(shù)特征摘要】
1.一種蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，包括：
(1)樣品預(yù)處理；
(2)樣品提取，具體包括：
向預(yù)處理后的樣品中加入Na2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋，再加入甲醇，震蕩提取3～5次，每次1～3h，然后離心，合并上清液，得到樣品提取液；
(3)濃縮純化；
(4)分析檢測。


2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的樣品預(yù)處理具體包括：將樣品冷凍干燥至恒重后，用研缽將其研磨均勻，并過50～70目篩。


3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的樣品為生長在含咖啡因廢水中的蔬菜樣品。


4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(2)中，樣品提取，具體包括：
向預(yù)處理后的樣品中加入100～200mg/LNa2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋0.5min～3min，再加入甲醇，20℃～30℃下150rpm～250rpm震蕩提取3～5次，每次1～3h，然后8000～12000rpm離心5～15min，合并上清液，得到樣品提取液；
所述的預(yù)處理后的樣品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比為500mg：1～4mL：10～40ml。


5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(2)中，樣品提取，具體包括：
向預(yù)處理后的樣品中加入150mg/LNa2EDTA水溶液，充分?jǐn)嚢璨u旋1min，再加入甲醇，25℃下200rpm震蕩提取4次，每次2h，然后10000rpm離心10min，合并上清液，得到樣品提取液；
所述的預(yù)處理后的樣品、Na2EDTA水溶液、甲醇的用量之比為500mg：2mL：20mL。


6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的濃縮純化，具體包括：
將樣品提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋蒸時(shí)20℃～40℃水浴加熱；
依次用甲醇和去離子水活化固相萃取柱，將兩種小柱ProElutCARB/NH2和ProElutCARB/PSA組裝到一起，將濃縮液過以上兩種小柱，并用甲醇分次不斷抽真空洗脫；
洗脫液合并后旋蒸，然后氮吹濃縮至恰好吹干，用甲醇定容，過濾，保存。


7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蔬菜植物中咖啡因及其代謝產(chǎn)物的測定方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的氮吹濃縮的干浴溫度為30℃～40...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：汪海燕，陳妍，張素芬，葉慶富，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33