本發明專利技術公開了一種手性止血多肽及其制備方法與應用，該手性止血多肽的結構式如式(Ⅰ)所示。其制備方法包括：樹脂的活化，氨基酸的耦聯，多肽的切除和沉淀，多肽的分離純化。本發明專利技術制得的手性止血多肽有良好的生物相容性，不會引起傷口部位的炎性反應，具有結合鈣離子的功能，且在止血與骨再生等方面表現出優異的效果。果。果。果。
【技術實現步驟摘要】
一種手性止血多肽及其制備方法與應用
[0001]本專利技術屬于生物工程
，涉及一種手性止血多肽及其制備方法與應用。
技術介紹
[0002]牙拔除術后出血是口腔臨床工作中最常見的并發癥，大多因局部因素引起，如處理不及時可導致嚴重的并發癥。填塞法是最常見的拔牙窩出血處理方式，合理使用局部止血材料充填拔牙窩是治療及預防拔牙后出血的重要措施。傳統拔牙窩止血材料
?
碘仿紗條是早年常用的止血材料，但因其不可降解，需二次手術取出延遲拔牙窩愈合，已逐漸被淘汰。
[0003]常用的止血材料包括明膠海綿、纖維蛋白膠和醫用膠原蛋白。因明膠海綿價格低廉，是臨床上常用的拔牙后止血填充材料。但明膠海綿易軟化，不適合用于拔牙窩大量出血，易被血液沖出，無法達到止血效果。纖維蛋白膠是從人或哺乳動物血漿制備而來，主要成分是黏蛋白和凝血酶濃縮物，通過高濃度的纖維蛋白原及凝血因子模擬機體凝血過程形成纖維蛋白膜達到止血作用，且可用于凝血功能障礙的患者，但由于其是血液制品存在誘發免疫反應風險。醫用膠原蛋白是膠原蛋白制作的膠原塞，通過吸收水分或血液后可膨脹，能粘附于組織表面，達到止血效果。在出血量較大的情況下，膠原塞也不易軟化。盡管上述臨床上使用的止血材料充填及覆蓋拔牙窩后均有一定的止血效果，然而在預防及快速控制失血方面尚存在不足。
[0004]隨著研究發現，近年研究人員利用自組裝多肽水凝膠在大組織器官損傷止血方面取得一定成效，如肝外傷止血、心臟穿透止血，因其不用縫合且具有良好生物相容性和安全性，作為止血材料具有獨特地優勢。自組裝多肽水凝膠原理是通過多肽在疏水作用、靜電作用和氫鍵結合等非共價弱相互作用的驅動下，自組裝多肽可以在出血部位凝膠化，進而顯著減少失血。這種由弱相互作用驅動的自我組裝成特定的網絡納米結構形成物理屏障，但微弱的閉合體間相互作用使得它們較脆弱。同時，自組裝多肽水凝膠能否用于口腔拔牙止血也難以預期。
[0005]現有臨床上常用拔牙窩止血材料，如明膠海綿和醫用膠原蛋白，大都通過機械壓迫方式借助材料吸血膨脹，粘附，凝血，達到止血效果。盡管上述材料都具有一定的止血功效，但是部分止血材料對大量出血或凝血功能障礙無效，且止血材料本身缺少與機體相互作用機制，不能達到快速止血效果。而現有的自組裝多肽水凝膠，多肽由于其特殊的分子結構，容易被蛋白酶識別和水解，難以兼顧穩定性與功效性。
技術實現思路
[0006]本專利技術目的在于解決現有的明膠海綿、纖維蛋白膠、醫用膠原蛋白、自組裝多肽水凝膠等止血材料存在的止血速度緩慢、止血效果不佳、功能相對單一、難以兼顧穩定性與功效性等問題。
[0007]基于上述目的，本專利技術提供了以D型氨基酸為原料的一種手性止血多肽來解決本
領域內的這種需要。
[0008]一方面，本專利技術涉及一種手性止血多肽，一種手性止血多肽結構式如式(Ⅰ)所示：
[0009][0010]另一方面，本專利技術涉及一種手性止血多肽的制備方法，其包括：
[0011]樹脂的活化：DMF浸泡溶脹樹脂30min，去除液體后，采用DMF和DCM交替洗滌2次，然后用DMF洗滌2次，每次洗滌時間為30s。；
[0012]氨基酸的耦聯：依照式(Ⅰ)所示多肽結構式的氨基酸序列，將D型氨基酸經HBTU/HOBT、DIEA活化后加入樹脂，從C端至N端進行順序反應得到含多肽的樹脂；
[0013]多肽的切除和沉淀：將所述含多肽的樹脂置于切割液中2～3h，經冰乙醚沉淀，50％乙腈水重懸，0.45μM濾膜過濾，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去離子水計，包含1mL去離子水、17.6mL TFA、0.4mL Tips和0.7g苯酚；
[0014]多肽的分離純化：將所述凍干的粗品多肽溶于6M鹽酸胍水溶液中，使用制備反相C18液相色譜(HPLC)分離所述多肽粗品，收集主要峰產物。
[0015]具體地，在本專利技術提供的一種手性止血多肽的制備方法中，其包括：
[0016](1)以Rink Amide MBHA樹脂為固相載體，稱取樹脂倒入反應器內，加入10mL DMF浸泡溶脹，上下翻轉30min，抽干液體，用DMF，DCM交替洗滌二次，最后用DMF洗滌2次，每次30s。
[0017](2)用含20％哌啶的DMF洗脫Fmoc 2次，分別為5min，10min。2次洗脫中間用DMF洗滌1次，洗滌30s，之后依次用DMF，DCM交替洗滌二次，最后用DMF洗滌2次，每次30s。將DMF溶解的第一個D型氨基酸經HBTU/HOBT、DIEA活化30s后，混合到樹脂中，室溫上下翻轉反應30min。抽濾，用DMF，DCM交替洗滌二次，最后用DMF洗滌2次，每次30s。重復上一流程。按照式(Ⅰ)所示多肽結構式的氨基酸序列順序從C端至N端依次反應即可得到含手性止血多肽的樹脂。
[0018](3)將反應完的樹脂用甲醇和DCM依次洗滌4次，干燥樹脂，將樹脂轉移到耐酸堿的20mL玻璃瓶中，瓶中含有17.6mL三氟乙酸,0.4mL Tips、1mL去離子水，0.7g苯酚的切割液，置于磁力攪拌器下，室溫下攪拌反應2～3h，轉速為550rpm。反應完成后，將切割液緩慢倒入裝有冰乙醚的50mL離心管中，析出白色沉淀，離心棄上清(4度，4000rpm，3min)，乙醚洗滌3次。最后用50％乙腈水重懸，0.45μM濾膜過濾，液體收集在50mL離心管中，液氮速凍，獲得多肽粗品。
[0019](4)將凍干的多肽粗品溶于6M鹽酸胍水溶液中，0.22μM濾膜過濾，使用制備反相C18液相色譜(HPLC)分離粗產物。收集主要峰產物進行電噴霧質譜鑒定，其中液相流速0.1mL/min，流動相為50％CAN(含千分之一甲酸)，在冷凍干燥機上冷凍干燥，得到所述手性止血多肽，多肽樣品
?
20℃保存。
[0020]另一方面，本專利技術涉及一種凝膠，其包括手性止血多肽和鈣離子溶液。
[0021]進一步地，在本專利技術提供的一種凝膠中，每100L的1g/L鈣離子溶液與0.5～10g所
述手性止血多肽混合。
[0022]本專利技術對多肽進行修飾和改造，以D型氨基酸為原料，制備得到一種手性止血多肽，其為鈣離子結合肽，在鈣離子的作用下，多肽序列自組裝為納米線，兼顧了穩定性與功效性。由本專利技術提供的由一種手性止血多肽制備的凝膠經試驗證明其展現出良好的止血及生物相容性，體內應用不引起局部及全身炎癥反應，且機體內降解時間短，已到達促進止血以及傷口愈合和骨再生的功效。由此，本專利技術進一步請求保護由本專利技術提供的手性止血多肽制備的凝膠在制備止血材料中的應用和在制備促進骨再生材料中的應用。基于上述應用，本專利技術進一步請求保護基于本專利技術在無創造性活動下可得到的一種止血材料、一種止血組合物和一種促進骨再生的組合物。
[0023]與現有技術相比，本專利技術的有益效果或優點：
[0024]本專利技術提供的由手性止血多肽制備的凝膠經試驗證明其展現出良好的止血及生物相容性，體內應用不引起局部及全身炎癥反應，且機體內降解時間短，兼具促進止血、傷口本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種手性止血多肽，其特征在于，所述一種手性止血多肽結構式如式(Ⅰ)所示：2.一種手性止血多肽的制備方法，其特征在于，包括：樹脂的活化：DMF浸泡溶脹樹脂30min，去除液體后，采用DMF和DCM交替洗滌2次，然后用DMF洗滌2次，每次洗滌時間為30s。；氨基酸的耦聯：依照式(Ⅰ)所示多肽結構式的氨基酸序列，將D型氨基酸經HBTU/HOBT、DIEA活化后加入樹脂，從C端至N端進行順序反應得到含多肽的樹脂；多肽的切除和沉淀：將所述含多肽的樹脂置于切割液中2～3h，經冰乙醚沉淀，50％乙腈水重懸，0.45μM濾膜過濾，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去離子水計，包含1mL去離子水、17.6mL TFA、0.4mL Ti...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉文佳，何旺驍，閆瑾，
申請(專利權)人：陜西未來多肽生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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