本發(fā)明專利技術(shù)中公開了一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法，使用實時熒光定量PCR技術(shù)對輸水系統(tǒng)中淡水殼菜的DNA絕對含量進行檢測，用于擴增所述淡水殼菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)使用實時熒光定量PCR法對水體中淡水殼菜DNA含量進行絕對定量的檢測，該檢測方法簡單易操作，靈敏度稿，快速且有效，成本低廉，可廣泛應用于水體中入侵物種淡水殼菜成分的量化鑒定。侵物種淡水殼菜成分的量化鑒定。侵物種淡水殼菜成分的量化鑒定。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法
[0001]本專利技術(shù)涉及生物
，尤其涉及一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法。
技術(shù)介紹
[0002]淡水殼菜又名沼蛤，生物學上隸屬于軟體動物、雙殼類和貽貝科。側(cè)面像一個三角形；腹面較平坦，隆起的一面是背部；腹面有兩個開口，有咬合齒和足絲，表面主要由淺綠色、棕色等混合而成，一般隨著年齡的增長，外殼顏色較深。主要以浮游藻類，有機物和微生物為食，喜食浮游藻類(藍藻和綠藻)的濾食性生物，幼蟲約100
?
500um，成蟲約8
?
30mm。高約10mm,外殼薄，但較硬。淡水殼菜在幼蟲變態(tài)后具有豐富的足絲，以此固著水下磚石，船舶、碼頭的木樁、堤壩、管道上等，易堆積成塊生活，且易生活在較干凈的水質(zhì)中。
[0003]淡水殼菜易隨水流進入輸水管道系統(tǒng)中，其存在對長距離地下箱涵輸水系統(tǒng)是一種巨大的隱患，淡水殼菜分泌的足絲易產(chǎn)生酸液具有較強的腐蝕作用；較強的附著能力促使其很難移動，較低的水速使其易在管道拐角處形成堆積狀態(tài)，減少管道過流面積，堵塞管道，增大管道輸水能耗。并且極大的影響了水質(zhì)，對人類的身體健康造成了隱患。但是地下輸水系統(tǒng)取水口處無法進行排空以致無法對淡水殼菜進行密度和大小進行定量，所以，建立一套快速解析箱涵關(guān)鍵物種淡水殼菜含量的檢測方法是十分必要的。
技術(shù)實現(xiàn)思路
[0004]本專利技術(shù)的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不能快速有效地檢測地下輸水系統(tǒng)管道中淡水殼菜含量的問題，提供一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法，使用實時熒光定量PCR技術(shù)對輸水系統(tǒng)中淡水殼菜的DNA絕對含量進行檢測，用于擴增所述淡水殼菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0006]優(yōu)選地，包括以下步驟：
[0007]S1、以淡水殼菜DNA為模板進行PCR擴增，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為擴增引物；PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18
?
TVector獲得重組質(zhì)粒；
[0008]S2、測定S1中重組質(zhì)粒OD260的值，通過公式換算成拷貝數(shù)；并對S1中的重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋得到重組質(zhì)粒稀釋液，選擇重組質(zhì)粒的10
?2～10
?7倍稀釋液作為標準品用于制備標準曲線；
[0009]S3、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為擴增引物，使用SYBR熒光定量PCR法檢測標準品中淡水殼菜DNA的CT值，制得標準曲線；
[0010]S4、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為擴增引物，使用SYBR熒光定量PCR法檢測待測樣本中淡水殼菜DNA的CT值，將待測樣本中淡水殼菜DNA的CT值帶入S3制得的標準曲線中，計算獲得待測樣本中淡水殼菜的DNA絕對含量。
[0011]優(yōu)選地，所述S1中獲得的重組質(zhì)粒的長度為2937bp，所述重組質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]優(yōu)選地，所述S4中待測樣本來源于地下輸水系統(tǒng)管道中的水體。
[0013]進一步優(yōu)選，所述S1中PCR擴增的反應程序為：95℃保持3min之后，95℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持續(xù)35個循環(huán)。
[0014]進一步優(yōu)選，所述S3和S4中PCR反應程序為：95℃保持5min之后，95℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸40s，持續(xù)40個循環(huán)。
[0015]Real
?
time qPCR(實時熒光定量PCR)就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。本專利技術(shù)主要使用實時熒光定量PCR技術(shù)對淡水殼菜在長距離地下箱涵輸水系統(tǒng)中的大致數(shù)量進行快速有效的檢測。
[0016]本專利技術(shù)所具有的有益效果：本專利技術(shù)使用實時熒光定量PCR法對水體中淡水殼菜DNA含量進行絕對定量的檢測，該檢測方法簡單易操作，靈敏度稿，快速且有效，成本低廉，可廣泛應用于水體中入侵物種淡水殼菜成分的量化鑒定。
附圖說明
[0017]圖1為實施例1中標準品的熒光PCR擴增曲線；
[0018]圖2為實施例1中標準品的溶解曲線；
[0019]圖3為實施例1中根據(jù)標準品制備的標準曲線；
[0020]圖4為實施例2中待測樣品的熒光PCR擴增曲線；
[0021]圖5為實施例2中待測樣品的溶解曲線；
[0022]圖6為實施例1中淡水殼菜DNA片段的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[0023]圖7為實施例1中重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
具體實施方式
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本專利技術(shù)作進一步的說明。
[0025]ChamQ SYBR Color qPCR MasterMix(2X)試劑盒購自南京諾唯贊；大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。
[0026]實施例1
[0027](1)引物設(shè)計：從NCBI下載淡水殼菜的DNA序列，并設(shè)計用于淡水殼菜PCR擴增的引物序列，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0028](2)重組質(zhì)粒制備：以淡水殼菜DNA為模板進行PCR擴增，淡水殼菜DNA為環(huán)境eDNA樣品，通過對地下箱涵輸水系統(tǒng)中采集水樣，一般為2L，之后帶回實驗室使用0.45μm的濾膜對水樣進行抽濾，將濾到濾膜中的DNA使用FAST DNA spin kit for soil試劑盒提取。擴增引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。PCR反應擴增體系為：dNTP Mix 4μL，Ex Taq(DNA聚合酶)0.5μL，上下游引物各0.25μL(濃度為10μmol/L)、模板DNA 1μL，用滅菌水補齊至25μL。PCR反應程序:加熱變性95℃持續(xù)3min，在每一個循環(huán)中，先于95℃保持30s使模板變性，然后將溫度降到復性溫度56℃保持30s，最后在72℃保持40s持續(xù)35個循環(huán)，獲得PCR擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物電泳圖如附圖6所示，PCR擴增片段長度為245bp，擴增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。將PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18
?
TVector獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞后測序鑒定并保存；重組質(zhì)粒長度為2937bp，重組質(zhì)粒的核苷酸序
列如SEQ ID NO.3所示，重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如附圖7所示。
[0029](3)標準曲線制備：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒用超微量可見光紫外分光光度計測定質(zhì)粒OD260的值，通過公式換算成拷貝數(shù)(copies/μl)，質(zhì)粒起始拷貝數(shù)換算公式(copies/μl)＝濃度(ng/μl)*10
?9*6.02*10
23
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【技術(shù)保護點】
【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測輸水系統(tǒng)中淡水殼菜含量的方法，其特征在于，使用實時熒光定量PCR技術(shù)對輸水系統(tǒng)中淡水殼菜的DNA絕對含量進行檢測，用于擴增所述淡水殼菜DNA的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：S1、以淡水殼菜DNA為模板進行PCR擴增，以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為擴增引物；PCR擴增產(chǎn)物連接pMD18
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TVector獲得重組質(zhì)粒；S2、測定S1中重組質(zhì)粒OD260的值，通過公式換算成拷貝數(shù)；并對S1中的重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋得到重組質(zhì)粒稀釋液，選擇重組質(zhì)粒的10
?2～10
?7倍稀釋液作為標準品用于制備標準曲線；S3、以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為擴增引物，使用SYBR熒光定量PCR法檢測標準品中淡水殼菜DNA的CT值，制得標準曲線...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王孟堯，劉信勇，屈亮，馮劍豐，朱琳，
申請(專利權(quán))人：中國南水北調(diào)集團中線有限公司天津分公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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