一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙及其制備方法、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙，包括結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊和底板；其中結(jié)合墊一固定有待檢測(cè)抗原的抗體A偶聯(lián)氧化葡聚糖；結(jié)合墊二固定有ConA

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙及其制備方法、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法


[0001]本專利技術(shù)涉及免疫層析
，尤其涉及一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙，以及試紙的制備方法，和檢測(cè)試劑盒及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法。

技術(shù)介紹

[0002]目前抗原常用的檢測(cè)技術(shù)有：膠體金法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、熒光免疫層析、化學(xué)發(fā)光法等。膠體金法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PNA、ConA等；ELISA已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)；熒光免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)，以固定有檢測(cè)線(包被抗體或包被抗原)和質(zhì)控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，熒光標(biāo)記抗體或抗原固定于連接墊，通過毛細(xì)管作用使待分析物在層析條上移動(dòng)；化學(xué)發(fā)光法是利用化學(xué)發(fā)光測(cè)定化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物、催化劑、增敏劑、抑制劑，偶合反應(yīng)中的反應(yīng)物、催化劑、增敏劑的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

[0003]本專利技術(shù)主要是解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的技術(shù)問題，從而提供一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙盒檢測(cè)裝置，可以提高免疫層析平臺(tái)檢測(cè)的特異性和靈敏度。
[0004]本專利技術(shù)的上述技術(shù)問題主要是通過下述技術(shù)方案得以解決的：一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙，包括結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊和底板，所述結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊依次放置于底板上，結(jié)合墊二的頭部與結(jié)合墊一的尾部重疊，硝酸纖維素膜的頭部與結(jié)合墊二的尾部重疊，吸樣墊的頭部與硝酸纖維素膜的尾部重疊；
[0005]其中結(jié)合墊一固定有待檢測(cè)抗原的抗體A偶聯(lián)氧化葡聚糖；
[0006]結(jié)合墊二固定有ConA
?
偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球，以及抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球；
[0007]T線包被有待檢測(cè)抗原的抗體B；
[0008]C線包被有DNP。
[0009]優(yōu)選的，所述底板為PVC。
[0010]優(yōu)選的，所述結(jié)合墊一、結(jié)合墊二采用玻璃纖維、無紡布或?yàn)V紙制成。
[0011]優(yōu)選的，所述吸樣墊為濾紙。
[0012]優(yōu)選的，所述氧化葡聚糖為葡聚糖經(jīng)高碘酸鈉氧化而成。
[0013]優(yōu)選的，所述抗體A偶聯(lián)氧化葡聚糖為氧化葡聚糖與抗體A混合后，加入NaCNBH3反應(yīng)，再加入乙二胺反應(yīng)，然后加入NaBH4還原而成。
[0014]本專利技術(shù)還公開了一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括上述的免疫層析檢測(cè)
試紙，以及卡盒，所述試紙置于卡盒內(nèi)，卡盒在試紙的結(jié)合墊一對(duì)應(yīng)部位露出加樣孔，在試紙的結(jié)合墊二對(duì)應(yīng)部位露出稀釋液添加孔，在試紙的硝酸纖維素膜包被C線和T線對(duì)應(yīng)部位露出觀察窗。
[0015]本專利技術(shù)還公開了上述信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
[0016]1、制備結(jié)合墊一
[0017]1.2葡聚糖氧化：用高碘酸鈉氧化葡聚糖，反應(yīng)后加入過量乙二醇終止氧化反應(yīng)，透析獲得氧化葡聚糖；
[0018]1.2氧化葡聚糖偶聯(lián)抗體：氧化葡聚糖與抗目標(biāo)抗原的抗體A混合反應(yīng)后，用NaCNBH3還原成二元結(jié)合物，再投入乙二胺氨化，然后用NaBH4還原，之后透析除去乙二胺和NaBH4；
[0019]1.3結(jié)合墊一制備：將上一步獲得的氧化葡聚糖偶聯(lián)抗體固定到玻璃纖維墊上，制得結(jié)合墊一；
[0020]2、制備結(jié)合墊二
[0021]2.1ConA/抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球：量子點(diǎn)熒光微球活化后，加入ConA或抗DNP抗體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，然后封閉，備用；
[0022]2.2結(jié)合墊二制備：將ConA偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球以及抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球固定到玻璃纖維墊上，制得結(jié)合墊二；
[0023]3、制備包被C線和T線的硝酸纖維素膜
[0024]3.1用包被緩沖液稀釋抗目標(biāo)抗原的抗體B，獲得T線抗體；
[0025]3.2用包被緩沖液稀釋DNP
?
BSA，獲得C線抗體；
[0026]3.3將C線抗體、T線抗體分別包被在硝酸纖維素膜上，干燥，獲得包被C線和T線的硝酸纖維素膜；
[0027]4、組裝
[0028]將結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊依次放置于底板上，結(jié)合墊二的頭部與結(jié)合墊一的尾部重疊，硝酸纖維素膜的頭部與結(jié)合墊二的尾部重疊，吸樣墊的頭部與硝酸纖維素膜的尾部重疊，獲得量子點(diǎn)熒光免疫層析檢測(cè)試紙。
[0029]優(yōu)選的，步驟1.1葡聚糖氧化具體為：用pH7.0的20mmol/L磷酸緩沖液溶解一定量的葡聚糖，并配置100mg/mL的高碘酸鈉水溶液，將高碘酸鈉水溶液加入上述葡聚糖溶液中，使NaIO4與葡聚糖中單糖單元的摩爾比為1:3，葡聚糖終濃度為40mg/mL，避光30℃微弱攪拌反應(yīng)3小時(shí)后加入過量乙二醇終止氧化反應(yīng)，繼續(xù)避光30℃攪拌反應(yīng)15分鐘后取出，用去離子水或pH7.0的20mmol/L磷酸緩沖液進(jìn)行透析。
[0030]優(yōu)選的，步驟1.2氧化葡聚糖偶聯(lián)抗體具體為氧化葡聚糖與抗目標(biāo)抗原的抗體A混合反應(yīng)2小時(shí)后，用NaCNBH3還原成二元結(jié)合物，再投入乙二胺，氨化2小時(shí)后用NaBH4還原2小時(shí)，之后透析除去乙二胺和NaBH4。
[0031]優(yōu)選的，步驟2.1ConA/抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球具體為：取量子點(diǎn)熒光微球加MES，離心后加入少量MES超聲重懸，然后先加入NHS混勻后再加EDC，活化反應(yīng)時(shí)間不小于半小時(shí)，加MES，離心，去上清，再依次用LMES、緩沖液超聲清洗后，加緩沖液重懸，然后加入Con
?
A或抗DNP抗體開始偶聯(lián)反應(yīng)，再加入甘氨酸和乙醇胺，加入BSA封閉，用PBST清洗后，加
保存液清洗，用保存液重懸保存。
[0032]優(yōu)選的，步驟3.1中用包被緩沖液將抗目標(biāo)抗原的抗體B稀釋至1.0～2.0mg/mL。
[0033]優(yōu)選的，步驟3.2中用包被緩沖液將DNP
?
BSA稀釋至1.0～2.0mg/mL。
[0034]本專利技術(shù)還公開了一種信號(hào)放大的量子點(diǎn)熒光免疫層析檢測(cè)方法，基于上述的免疫層析檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，其特征在于其步驟包括：
[0035](1)打開量子點(diǎn)熒光免疫分析儀；
[0036](2)取50μL待測(cè)樣品滴加到免疫層析試紙條的加樣孔，5～10min后取100μL稀釋液滴加到稀釋液添加孔。
[0037](3)繼續(xù)孵育10～15min，將試劑盒放入量子點(diǎn)熒光免疫分析儀中讀取檢測(cè)結(jié)果。
[0038]本專利技術(shù)的伴刀豆球蛋白與葡萄糖反應(yīng)信號(hào)放大的熒光免疫檢測(cè)方法技術(shù)路線為：首先將某一特定抗原特異的抗體A與氧化葡聚糖偶聯(lián)，固定在結(jié)合墊一上；分別將伴刀豆球蛋白(ConA)與量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)，抗DNP抗體與量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)，將兩種量本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
1.一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：包括結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊和底板；其中結(jié)合墊一固定有待檢測(cè)抗原的抗體A偶聯(lián)氧化葡聚糖；結(jié)合墊二固定有ConA
?
偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球，以及抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球；T線包被有待檢測(cè)抗原的抗體B；C線包被有DNP。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述結(jié)合墊一、結(jié)合墊二、包被C線和T線的硝酸纖維素膜、吸樣墊依次放置于底板上，結(jié)合墊二的頭部與結(jié)合墊一的尾部重疊，硝酸纖維素膜的頭部與結(jié)合墊二的尾部重疊，吸樣墊的頭部與硝酸纖維素膜的尾部重疊。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述底板為PVC。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述結(jié)合墊一、結(jié)合墊二采用玻璃纖維、無紡布或?yàn)V紙制成。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述吸樣墊為濾紙。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述氧化葡聚糖為葡聚糖經(jīng)高碘酸鈉氧化而成。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析檢測(cè)試紙，其特征在于：所述抗體A偶聯(lián)氧化葡聚糖為氧化葡聚糖與抗體A混合后，加入NaCNBH3反應(yīng)，再加入乙二胺反應(yīng)，然后加入NaBH4還原而成。8.一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1
?
7中任一項(xiàng)所述的免疫層析檢測(cè)試紙，以及卡盒，所述試紙置于卡盒內(nèi)，卡盒在試紙的結(jié)合墊一對(duì)應(yīng)部位露出加樣孔和稀釋液添加孔，在試紙的硝酸纖維素膜包被C線和T線對(duì)應(yīng)部位露出觀察窗。9.一種信號(hào)放大的免疫層析檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于包括以下步驟：1、制備結(jié)合墊一1.1葡聚糖氧化：用高碘酸鈉氧化葡聚糖，反應(yīng)后加入過量乙二醇終止氧化反應(yīng)，透析獲得氧化葡聚糖；1.2氧化葡聚糖偶聯(lián)抗體：氧化葡聚糖與抗目標(biāo)抗原的抗體A混合反應(yīng)后，用NaCNBH3還原成二元結(jié)合物，再投入乙二胺氨化，然后用NaBH4還原，之后透析除去乙二胺和NaBH4；1.3結(jié)合墊一制備：將上一步獲得的氧化葡聚糖偶聯(lián)抗體固定到玻璃纖維墊上，制得結(jié)合墊一；2、制備結(jié)合墊二2.1ConA/抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球：量子點(diǎn)熒光微球活化后，加入ConA或抗DNP抗體進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，然后封閉，備用；2.2結(jié)合墊二制備：將ConA偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球以及抗DNP抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)熒光微球固定到玻璃纖維墊上，制得...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董常慧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京美寧康誠(chéng)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：