針對AFP-L3與凝集素復合物的單克隆抗體及其試劑盒和應用制造技術

本申請提供一種針對AFP

【技術實現步驟摘要】
針對AFP
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L3與凝集素復合物的單克隆抗體及其試劑盒和應用


[0001]本申請涉及醫療器械及體外診斷領域，具體涉及一種針對AFP
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L3與凝集素復合物的單克隆抗體、去糖基化的甲胎蛋白抗體的制備及其試劑盒和應用。

技術介紹

[0002]2020年全球因肝癌死亡人數近83萬，肝癌是世界范圍內第三位常見的惡性腫瘤，2020年全球新增90萬肝癌患者，在所有新增癌癥患者人數上排名第6，因此，控制肝癌發生發展的嚴峻形勢刻不容緩。原發性肝癌分為肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌(ICC)和HCC
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ICC混合型，其中HCC占85％
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90％。乙肝、丙肝、過度飲酒、吸煙等能導致肝細胞癌，但肝細胞癌的發病機制至今仍未清楚，其在臨床上惡性度較高，所以早期篩查與診斷是提高患者生存率的關鍵，而大多數患者就診時已屆中晚期，失去了最佳治療時機，要得到有效治療，篩查和普查的臨床效率依賴于早期診斷。
[0003]甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是一種糖蛋白，分子量約為70KD，在哺乳動物中主要由胎兒肝細胞和卵黃囊細胞合成。當肝細胞發生癌變時，部分AFP的糖鏈會發生變化。根據甲胎蛋白(AFP)與小扁豆凝集素(LCA)的親和力差異，AFP可分為AFP
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L1、AFP
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L2、AFP
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L3，AFP
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L1主要見于良性肝病，AFP
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L2主要由卵黃囊產生并多見于孕婦，而AFP
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L3主要來源于肝癌細胞，也被稱為甲胎蛋白異質體。AFP
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L3具有α
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巖藻聚糖，該聚糖能特異性結合LCA。HCC患者血清中AFP
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L3比其它良性肝病患者明顯升高，與HCC的發生密切相關，因此AFP
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L3是診斷肝細胞癌的重要指標。《中國臨床腫瘤學會(CSCO)原發性肝癌診療指南2020》推薦在肝癌患者中進行甲胎蛋白異質體檢測，美國食品與藥品監督管理局(FDA)已于2005年批準甲胎蛋白異質體檢測試劑和方法用于臨床肝癌預警。
[0004]目前，用于甲胎蛋白異質體的檢測方法有植物凝集素親和層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、親和印跡法、免疫電泳法、親和離心柱法、化學發光法等。植物凝集素親和層析法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、親和印跡法等方法操作繁瑣，耗時，步驟復雜，對操作人員素質要求高，無法實現高通量檢測。
[0005]目前，有使用F(ab
’
)2片段、Fab
’
片段、Fab片段、Fv片段以及去糖基化修飾的甲胎蛋白抗體作為捕獲抗體組合吖啶標記小扁豆凝集素來進行AFP
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L3檢測的方法。該方法中需要提前對甲胎蛋白抗體進行處理，切除Fc段獲得F(ab
’
)2，Fab，Fab
’
，這類抗體與磁珠等固相載體偶聯后的空間位阻也不易抗體與抗原的結合，該過程操作復雜難度大，試劑成本增加。另外，也有一種識別糖肽的單抗制備方法，糖肽包含一個核心巖藻糖基化基序和糖基化天冬酰胺基序C端部分氨基酸序列。盡管該單克隆抗體的特異性較強，但操作復雜、制備難度大，其靈敏度不高，臨界值附近的樣本難以區分陰陽性。

技術實現思路

[0006]基于此，本申請有必要提供一種針對AFP
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L3與凝集素復合物的單克隆抗體及其檢測試劑盒，并用于制備甲胎蛋白異質體檢測產品，該產品準確性好、靈敏度高且操作簡單、
檢測時間短。
[0007]具體技術方案如下：
[0008]本申請的第一方面，提供了一種針對AFP
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L3與凝集素復合物的單克隆抗體，所述單克隆抗體包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重鏈可變區CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的重鏈可變區CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重鏈可變CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的輕鏈可變區CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的輕鏈可變區CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的輕鏈可變區CDR3。
[0009]在其中一個實施例中，所述單克隆抗體包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的重鏈可變區和氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的輕鏈可變區。
[0010]本申請的第二方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包括編碼第一方面所述的單克隆抗體的核苷酸序列。
[0011]本申請的第三方面，提供了含有第二方面所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料包括載體或宿主細胞。
[0012]本申請的第四方面，提供了一種去糖基化的抗體，所述抗體的Fc段的糖鏈上連接有交聯劑或凝集素。可選地，所述抗體包括甲胎蛋白抗體。
[0013]在其中一個實施例中，所述交聯劑與抗體Fc段的糖鏈上的羥基反應，通過化學鍵相連；所述凝集素通過分子間作用力與抗體的Fc段的糖鏈相連。
[0014]在其中一個實施例中，所述交聯劑含有環氧基；可選地，所述交聯劑包括至少兩個環氧基。
[0015]在其中一個實施例中，所述交聯劑為同型雙功能交聯劑。
[0016]在其中一個實施例中，所述同型雙功能交聯劑包括1,4
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丁二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、三羥甲基丙烷三縮水甘油醚。
[0017]本申請的第五方面，提供了上述任一項去糖基化的抗體的制備方法，包括采用交聯劑或凝集素對抗體的糖鏈進行處理，以減少所述抗體Fc段糖鏈與凝集素反應。
[0018]在其中一個實施例中，所述交聯劑對抗體的糖鏈進行處理的步驟包括將抗體和交聯劑按照摩爾比為1：(5
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50)進行反應。
[0019]在其中一個實施例中，所述交聯劑對抗體的糖鏈進行處理的步驟包括將抗體、修飾劑及交聯劑按照摩爾比為1：(20
?
100)：(5
?
50)進行反應。
[0020]可選地，修飾劑包括PEG系列、小分子多肽和含羥基的氨基酸中的至少一種。
[0021]在其中一個實施例中，所述凝集素對抗體的糖鏈進行處理的步驟包括將抗體與凝集素按照摩爾比為1：(1
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200)進行反應。
[0022]在其中一個實施例中，所述凝集素包括動物凝集素和植物凝集素中的一種或多種；可選地，所述植物凝集素包括小扁豆凝集素、橙黃網胞盤菌凝集素、刀豆凝集素、麥胚素、花生凝集素和大豆凝集素以及蓮藕凝集素中的一種或多種。
[0023]本申請的第六方面，提供了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的單克隆抗體。
[0024]在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括甲胎蛋白抗體或去糖基化的甲胎蛋白抗體。可選地，所述去糖基化的甲胎蛋白抗體采用包括第五方面所述的制備方法得到。
[0025]在其中一個實施例中，所述試劑盒包括包本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種針對AFP
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L3與凝集素復合物的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重鏈可變區CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的重鏈可變區CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重鏈可變CDR3、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的輕鏈可變區CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的輕鏈可變區CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的輕鏈可變區CDR3。2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，所述單克隆抗體包括氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的重鏈可變區和氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的輕鏈可變區。3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括編碼權利要求1或2所述的單克隆抗體的核酸片段。4.含有權利要求3所述的核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括載體或宿主細胞。5.一種去糖基化的抗體，其特征在于，所述抗體的Fc段的糖鏈上連接有交聯劑或凝集素。6.根據權利要求5所述的抗體，其特征在于，所述交聯劑與抗體Fc段的糖鏈上的羥基反應，通過化學鍵相連；所述凝集素通過分子間作用力與抗體的Fc段的糖鏈相連。7.根據權利要求5或6所述的抗體，其特征在于，所述交聯劑含有環氧基；可選地，所述交聯劑包括至少兩個環氧基；可選地，所述交聯劑為同型雙功能交聯劑；所述同型雙功能交聯劑包括1,4
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丁二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚和三羥甲基丙烷三縮水甘油醚中的至少一種。8.權利要求5
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7任一項所述抗體的制備方法，其特征在于，包括采用交聯劑或凝集素對抗體的糖鏈進行處理，以減少所述抗體Fc段糖鏈與凝集素反應。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述交聯劑對抗體的糖鏈進行處理的步驟包括將抗體和交聯劑按照摩爾比為1：(5
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50)進行反應。10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述交聯劑對抗體的糖鏈進行處理的步驟包括將抗體、修飾劑及交聯劑按照摩爾比為1：(20
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100)：(5<...

【專利技術屬性】
技術研發人員：祝亮，肖文超，譚松暖，尹智偉，譚暉，何凡，
申請(專利權)人：深圳市卓潤生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：