用于檢測HIV-1DNA整合酶區域耐藥突變的試劑盒及應用方法技術

本申請公開了用于檢測HIV

【技術實現步驟摘要】
用于檢測HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的試劑盒及應用方法


[0001]本申請涉及生物檢測
，尤其涉及用于檢測HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的引物組、包含該引物組的HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變檢測試劑盒及利用該試劑盒檢測HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的方法。

技術介紹

[0002]艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是人類感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)后導致機體免疫功能低下或缺陷，繼而引起一系列機會性感染及惡性腫瘤，嚴重者可引起死亡的綜合征。據估計，2020年全球感染HIV約有3770萬人，死亡人數68萬人，且每年約有150萬新發感染者高效抗逆轉錄病毒聯合療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)能極大改善HIV感染者的預后，可幫助艾滋病病毒感染者減緩病毒復制速度，提高機體免疫力并延長患者壽命，是目前預防和治療艾滋病最有效的方法。
[0003]現已經開發使用的抗病毒藥物可以分為核苷類反轉錄酶抑制劑(nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NRTIs)、非核苷類反轉錄酶抑制劑(non
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nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitors,PIs)、整合酶抑制劑(integrase inhibitors,INIs)、CCR5受體抑制劑(CCR5 receptor inhibitors,RIs)和融合酶抑制劑(fusion inhibitors,FIs)等六大類。國內使用的治療艾滋病藥物主要有三大類，非核苷類反轉錄酶抑制劑、核苷類反轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，且這三類藥物即可單獨使用也可聯合用藥提高治療效果。但隨著這三類藥物的研究和利用，HIV
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1的耐藥性不斷累積，在抗病毒藥物上的效果被減弱，進而促使整合酶抑制劑研究的發展。INIs是最新的抗HIV
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1治療藥物，主要針對整合酶區發揮作用，阻斷病毒基因組整合至人體基因組的過程，并抑制整合酶其他相關作用，從而快速降低血漿中HIV
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1RNA濃度。
[0004]2007年第一個整合酶抑制劑(INSTI)—拉替拉韋在美國上市，2010年艾維雷韋與多替拉韋上市。目前，已在國內獲得批準并上市的整合酶抑制劑有：拉替拉韋、多替拉韋、艾維雷韋。另外Bictegravir(商品名必妥維)也已經獲得審評。且部分整合酶抑制劑藥物已納入醫保。因此，對整合酶類藥物的耐藥程度檢測是十分必要的。
[0005]目前，我國在整合酶區域耐藥的研究較少，由于INIs上市時間短，耐藥屏障高，且人體細胞結構中沒有整合酶，毒副作用較小，更有利于患者治療。此外，在我國普遍將病毒載量(viral load,VL)>1000copies/mL認為是抗病毒治療失敗的患者，且Sanger測序的傳統HIV
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1RNA基因耐藥檢測方法通常只能檢測VL≥1000copies/mL的HIV
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1感染者，當VL<1000copies/mL時，病毒基因的擴增失敗率較高，《全國艾滋病檢測技術規范(2015年修訂版)》指出：當耐藥毒株在病毒群體中低于10％～20％時，通常檢測不到其存在。2018年，加拿大艾滋病診療指南中還提出對HIV
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1RNA<1000copies/mL的患者，可以進行HIV
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1前病毒DNA基因型耐藥檢測。此外，《全國艾滋病檢測技術規范(2020年修訂版)》在全球范圍內首次
將HIV
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1前病毒DNA定量檢測納入檢測規范中，文中指出：HIV
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1前病毒DNA定量檢測可判定HIV
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1儲存庫含量，可更準確預測HIV
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1傳播風險和病程發展。
[0006]HIV病毒在感染人體后，病毒首先進入免疫細胞，脫外殼后由遺傳物質RNA逆轉錄成DNA后進入細胞核，大多數HIV
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1DNA會整合在人類基因組上，形成穩定的病毒儲存庫。HIV
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1DNA作為復制模板，轉錄子代RNA，翻譯蛋白并包裝成子代病毒。因此HIV
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1DNA作為前病毒，攜帶了更深層更多的遺傳信息，對HIV
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1DNA耐藥監測有可能獲得更多的耐藥信息，甚至可以提前預測耐藥發生。
[0007]因此，為滿足市場需求，亟需開發一種用于檢測HIV
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1DNA整合酶耐藥的檢測方法，并實現在低濃度HIV
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1DNA上的耐藥檢測。

技術實現思路

[0008]針對現有技術的問題，本申請提供了一種HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的檢測方法，所述檢測方法可應用于HIV
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1DNA所有濃度包括低濃度時的整合酶耐藥檢測，其中HIV
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1DNA低濃度低于200copies/mL，高濃度高于200copies/mL，所述檢測方法以抗凝全血、精液、腦脊液、干血斑等做為樣本，采用特定引物組，通過巢式PCR方法擴增HIV
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1整合酶區域，并通過Sanger測序方法測定擴增序列，將獲得的相關基因片段序列，與野生型序列和耐藥毒株的信息比較，分析耐藥相關基因突變，利用基因型耐藥解釋系統判斷是否耐藥以及耐藥的程度，從而為患者制定一線抗病毒治療、二線治療方案、暴露前/后預防用藥方案和制定減少耐藥發生的措施等提供參考依據。
[0009]第一方面，本申請提供了一種引物組，所述引物組用于擴增HIV
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1DNA整合酶區域，所述引物組包括：
[0010]第一引物組，所述第一引物組包括第一組上游引物和第一組下游引物，所述第一組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：1～26的引物中的至少一種；所述第一組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：27～55的引物中的至少一種；以及第二引物組，所述第二引物組包括第二組上游引物和第二組下游引物，所述第二組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：56～82的引物中的至少一種；所述第二組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：83～112的引物中的至少一種。
[0011]進一步地，所述引物組的引物序列中，A代表腺嘌呤、G代表鳥嘌呤、C代表胞嘧啶、T代表胸腺嘧啶；字母R/D/V/Y/N/B代表混合堿基；其中，R代表A+G；D代表A+G+T；V代表A+G+C；Y代表C+T；N代表A+G+C+T；B代表C+G+T。
[0012]進一步地，所述第一組上游引本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.用于擴增HIV
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1DNA整合酶區域的引物組，其特征在于，所述所述引物組包括：第一引物組，所述第一引物組包括第一組上游引物和第一組下游引物，所述第一組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：1～26的引物中的至少一種；所述第一組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：27～55的引物中的至少一種；以及第二引物組，所述第二引物組包括第二組上游引物和第二組下游引物，所述第二組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：56～82的引物中的至少一種；所述第二組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：83～112的引物中的至少一種。2.一種用于檢測HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括DNA提取液、PCR反應液；其中所述PCR反應液包括：用于擴增HIV
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1整合酶區域DNA的引物組，所述引物組包括：權利要求1所述的引物組。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述第一組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：1～26的引物中的至少N種，其中，N為2～26中的任一自然數；所述引物組第一組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：26～55的引物中的至少W種，其中，W為2～30中的任一自然數；所述引物組第二組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：56～82的引物中的至少T種，其中，T為2～27中的任一自然數；所述引物組第二組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：83～112的引物中的至少Q種，其中，Q為2～30中的任一自然數。4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述第一組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：1～26的全部引物；所述第一組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：27～55的全部引物；所述第二組上游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：56～82的全部引物；所述第二組下游引物包括核苷酸序列為SEQ ID NO：83～112的全部引物。5.根據權利要求2～4任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括一種測序引物組，所述測序引物組用于對HIV
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1整合酶區域基因擴增產物進行測序，所述擴增產物為通過權利要求1所述引物組PCR擴增獲得；所述測序引物組包括核苷酸序列為SEQ ID NO：113～138的引物中的至少四種，所述測序引物組包括正向測序引物和反向測序引物。6.一種HIV
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1DNA整合酶區域耐藥突變的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：提取待檢樣品DNA；以提取的DNA為模板，利用權利要求2～5任一項檢測盒中的所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳彩紅，朱托夫，鄧可基，
申請(專利權)人：廣州海力特生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：