一種單鏈DNA制備方法技術

本發明專利技術涉及一種單鏈DNA制備方法，包括如下步驟：(1)準備具有粘性末端的雙鏈DNA序列和莖環引物，所述莖環引物包括成環部分和非成環部分，所述非成環部分含有與所述粘性末端互補的互補序列，利用所述互補序列與雙鏈DNA序列的所述粘性末端互補連接；(2)使用具有雙鏈外切酶活性的DNA外切酶對步驟(1)獲得的長莖環引物從5

【技術實現步驟摘要】
一種單鏈DNA制備方法


[0001]本專利技術一種單鏈DNA制備方法，屬于分子生物學


技術介紹

[0002]單鏈DNA是以單鏈狀態存在的DNA，在生命科學研究領域是一個重要的工具，普通引物合成都是單鏈DNA，可以用于PCR擴增和基因的測序，另外在核酸雜交領域，單鏈DNA可以用作探針與靶基因雜交，相比雙鏈探針，由于沒有雙鏈探針中互補鏈帶來的探針封閉效應，檢測靈敏度要高。
[0003]目前單鏈DNA通常采用化學合成法制備，但長度有限制，價格昂貴，產量也不高，也有一些通過酶促反應獲得，例如通過轉錄酶合成RNA，進而反轉錄成cDNA單鏈；通過單引物擴增，然后去除雙鏈模板獲得單鏈等，但這些方法大都存在產量低，純度低等特點。
[0004]申請公布號為CN110699407A的中國專利技術專利公開了一種長單鏈DNA的制備方法，該方法主要包括設計并構建重組噬菌粒，獲得噬菌粒環狀單鏈DNA步驟，同時采用I類脫氧核酶和II類脫氧核酶突變體切割環狀單鏈DNA，純化回收酶切得到長單鏈DNA。但是該方法需要設計并構建重組噬菌粒，存在操作流程復雜、不易大規模推廣使用的問題。

技術實現思路

[0005]本專利技術的目的是提供一種單鏈DNA制備方法，已解決現有技術中單鏈DNA制備流程復雜、產量和純度較低的問題。
[0006]為了實現上述目的，本專利技術中一種單鏈DNA制備方法的技術方案是：
[0007]一種單鏈DNA制備方法，包括如下步驟：
[0008](1)準備具有粘性末端的雙鏈DNA序列和莖環引物，所述莖環引物包括成環部分和非成環部分，所述非成環部分含有與所述粘性末端互補的互補序列，利用所述互補序列與雙鏈DNA序列的所述粘性末端互補連接；
[0009](2)使用具有雙鏈外切酶活性的DNA外切酶對步驟(1)獲得的長莖環引物從5
’
端或3
’
端進行酶切，直至切割至莖環位置停止，獲得單鏈DNA。
[0010]上述技術方案的有益效果在于：本專利技術設計合成莖環引物，與含有目標單鏈DNA的雙鏈DNA序列連接形成長莖環引物，利用雙鏈外切酶只對雙鏈DNA有活性，對單鏈DNA無活性，對形成長莖環引物從5
’
端或3
’
端進行酶切，獲得單鏈DNA。該方法操作簡便，無需復雜的操作流程，得率較高，且不受序列長度限制。
[0011]具體地，具有粘性末端的雙鏈DNA序列可以從含有目的片段的質粒中酶切獲得，也可以通過設計含有酶切位點(酶切后形成粘性末端)的引物，進行PCR擴增再進行酶切后獲得。若不想最后獲得的單鏈含有其他無關序列，可將目的序列的最后8
?
10個堿基作為莖環引物的成環序列，在后面添加最后8
?
10個堿基之前的反向互補序列，例如序列是a
?
b
?
c，a是400bp，b是20bp，c是8bp，單鏈制備時可分為長片段a和莖環引物b
?
c
?
b
’
，b
’
是b的反向互補序列。
[0012]作為進一步地改進，所述成環部分長度為8
?
10bp。
[0013]上述技術方案的有益效果在于：成環部分控制在上述長度可以減少不必要的二級結構，若成環序列過長，有可能會形成其他的二級結構，導致成環位置不唯一，會造成最后得到的單鏈不單一。
[0014]具體地，莖環引物的5
’
端磷酸化修飾。
[0015]作為進一步地改進，所述非成環部分包括互補臂和所述互補序列，互補臂的長度為18
?
22bp。
[0016]作為進一步地改進，所述莖環引物的成環部分和互補臂的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
[0017]上述技術方案的有益效果在于：上述序列引物經過退火后，可以形成特定二級結構的莖環引物。
[0018]作為進一步地改進，所述互補序列的長度為2
?
4bp。
[0019]上述技術方案的有益效果在于：常用的內切酶產生的末端大多是4堿基和2堿基，在制備時可以根據需要選擇適宜的內切酶，為實驗提供更多選擇。
[0020]作為進一步地改進，所述DNA外切酶為Exonuclease III酶，沿著長莖環引物3
’
端切割至莖環位置時，由于無雙鏈DNA結構，切割即停止。
[0021]上述技術方案的有益效果在于：Exonuclease III酶只對雙鏈DNA有活性，對單鏈DNA無活性，且易于購買，價格較低，制備單鏈DNA的成本較低。
[0022]作為進一步地改進，當目標的單鏈DNA為雙鏈DNA序列的正義鏈時，莖環引物與雙鏈DNA的3
’
端連接；當目標的單鏈DNA為雙鏈DNA序列的反義鏈時，莖環引物與雙鏈DNA的5
’
端連接。
[0023]與現有技術相比，本專利技術的有益效果：
[0024]第一，操作簡便，無需復雜的操作流程；
[0025]第二，成本較低，使用試劑都是市場上較易購買、價格較低的酶；
[0026]第三，得率較高，每次反應可得到10
?
30ug的單鏈產物；
[0027]第四，不受序列長度限制，可制備小至幾十個堿基，大至5
?
10kb的單鏈產物。
附圖說明
[0028]圖1為本專利技術實施例1中單鏈DNA制備的流程圖；
[0029]圖2為本專利技術實施例1中Bsa I單酶切后電泳圖(其中，M為marker DL5000(從上往下依次為5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100)，1為質粒Bsa I單酶切)；
[0030]圖3為本專利技術實施例1中引物退火后形成的莖環結構1；
[0031]圖4為本專利技術實施例1中引物退火后形成的莖環結構2；
[0032]圖5為本專利技術實施例1Exonuclease III酶切前后電泳結果(其中，M為marker DL5000(從上往下依次為5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250)，1為片段Exonuclease III酶切前，2為片段Exonuclease III酶切后)。
具體實施方式
[0033]下面，結合具體實施方式，對本專利技術做進一步描述，需要說明的是，在不相沖突的
前提下，以下描述的各實施例之間或各技術特征之間可以任意組合形成新的實施例。所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0034]實施例1
[0035]本實施例的單鏈DNA制備方法，從含有目標基因序列的質粒中獲取具有粘性末端的雙鏈DNA序列，再與莖環引物連接后，使用ExonucleaseIII酶切消化，純化后獲得單鏈DNA，制備原理如圖1所示，具體實施操作如下：...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種單鏈DNA制備方法，其特征在于：包括如下步驟：(1)準備具有粘性末端的雙鏈DNA序列和莖環引物，所述莖環引物包括成環部分和非成環部分，所述非成環部分含有與所述粘性末端互補的互補序列，利用所述互補序列與雙鏈DNA序列的所述粘性末端互補連接；(2)使用具有雙鏈外切酶活性的DNA外切酶對步驟(1)獲得的長莖環引物從5
’
端或3
’
端進行酶切，直至切割至莖環位置停止，獲得單鏈DNA。2.根據權利要求1所述的單鏈DNA制備方法，其特征在于：所述成環部分長度為8
?
10bp。3.根據權利要求1所述的單鏈DNA制備方法，其特征在于：所述非成環部分包括互補臂和所述互補序列，互補臂的長度為18
?
22bp。4.根據權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王少輝，李貴喜，李三華，郭曙光，霍清園，李丹洋，齊華，
申請(專利權)人：河南賽諾特生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：