【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法。
技術介紹
1、d-氨基酸屬于非天然蛋白質氨基酸，被廣泛用于制作化妝品、抗生素、止痛藥、減肥藥以及抗癌等醫療用品上。目前基于d-氨基酸在細菌生理代謝中的作用，還有許多新的醫療用品在持續開發中。
2、半胱氨酸化學名為2-氨基-3-巰基丙酸，分子式為c3h2no2s，相對分子質量121.12。半胱氨酸屬于脂肪族氨基酸，呈白色結晶性粉末，無臭、味酸、易被氧化，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、苯等有機試劑。根據構型不同，半胱氨酸分d型、l型和dl型，其中dl型為半胱氨酸的外消旋體。
3、d-半胱氨酸是合成第三代抗生素頭孢米諾鈉的重要中間體。頭孢米諾鈉對大腸桿菌、鏈球菌、克雷白桿菌、流感嗜血桿菌、擬桿菌等有很強抗菌作用，其對革蘭陰性菌的作用較其它同類的藥物更強。同時，d-半胱氨酸鹽酸鹽也是大腸桿菌的強抑制劑和急性酒精中毒的有效緩解劑。
4、目前，d-半胱氨酸的制備方法主要有誘導結晶法、化學拆分法、酶拆分法、不對稱轉化法。
5、(1)誘導結晶法
6、tadashi等人通過將濃氨水和dl-半胱氨酸鹽酸鹽混合獲得dl-半胱氨酸，加入丙酮反應獲得dl-2,2-二甲基四氫噻唑-4-羧酸，在40℃下使之形成過飽和溶液，加入d-2,2-二甲基四氫噻唑-4-羧酸作為晶種誘導結晶，過濾沉淀，水解產物獲得d-半胱氨酸，收率為2％。該法相對于其它方法雖然簡單，但是收率低，產物的光學純度也達不到理想的要求。
7、(2
8、張濤等人將dl-半胱氨酸鹽酸一水合物溶于水中，再將一定量的naoh和d-(-)-扁桃酸制成水溶液，升溫攪拌，使d-(-)-扁桃酸完全溶解，與dl-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液混合，將反應液置于冰浴中，待晶體大量析出時，過濾獲得d-半胱氨酸-d-扁桃酸；向獲得的d-半胱氨酸-d-扁桃酸中滴加稀鹽酸溶液，升溫完全溶解，冷卻析出d-半胱氨酸鹽酸鹽，產品的比旋光-7.4°，單次反應回收率為25.6％。該方法根據其化學性質的不同實現分離，光學純度也得以提高，但由于拆分過程中反應條件復雜，不利于環保和成本控制，在實際的工業生產中有一定的局限性。
9、(3)酶拆分法
10、酶拆分法具有反應條件溫和、操作步驟簡單、成本低廉等優點，因而引起了廣泛的關注。
11、koito等人以s-芐基-dl-半胱氨酸鹽酸鹽的水溶液為底物，以一種從豬肝提取的酶為催化劑，在37℃下，反應4h，將底物中的s-芐基-l-半胱氨酸鹽酸鹽水解，保留s-芐基-d-半胱氨酸，將其分離后通過脫芐基反應，制得d-半胱氨酸。該方法反應過程繁瑣、周期長，反應過程中要求底物濃度不能過高，反應效率低，最多只可能得到50％s-芐基-d-半胱氨酸。
12、(4)不對稱轉化法
13、shiariw等人將dl-半胱氨酸、r-酒石酸、丙酮和水楊醛置于乙酸中，在77℃下反應2.7h，然后置于冰浴中攪拌，經過過濾、洗滌、干燥，隨后在60℃條件下于乙醇中攪拌1h，可獲得d-半胱氨酸，光學純度可達到100％，收率為80％。
14、以上制備d-半胱氨酸的方法都存在一些缺點和不足。誘導結晶法雖然操作簡單，但其收率較低，僅為2％，且無法獲得理想的光學純度。化學拆分法中的反應條件復雜，需要大量的化學試劑，不利于環保和成本控制，并且單次反應回收率較低。酶拆分法雖然操作簡單，但反應時間長，操作步驟繁瑣，反應效率也較低。不對稱轉化法需要高溫反應條件，消耗大量能源，且對設備要求較高。因此，開發一種高效、簡便、低成本制備d-半胱氨酸的工藝勢在必行。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術中的不足之處，提供一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法。
2、為了實現本專利技術的目的，本專利技術將采用如下技術方案加以實施。
3、一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/l的l-谷氨酸鈉、5.4～8.0g/l的甘氨酸、14.2～20.6g/l的dl-半胱氨酸、1.3～1.8g/l的三磷酸腺苷和50～150g/l的六偏磷酸鈉的緩沖液為反應體系，加入具有谷胱甘肽雙功能合成酶突變體活性的基因工程菌細胞a或其粗酶液a和具有多聚磷酸激酶突變體活性的基因工程菌細胞b或其粗酶液b，在ph?7～9、30～45℃下反應，催化l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸生產谷胱甘肽，同時制得d-半胱氨酸。
4、作為本專利技術的優選方案，所述基因工程菌細胞a是以大腸桿菌e.coli?bl21(de3)為宿主，質粒pet-28a為表達載體，攜帶谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因形成的。
5、作為本專利技術的優選方案，所述谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因能夠編碼谷胱甘肽雙功能合成酶突變體。
6、作為本專利技術的優選方案，所述谷胱甘肽雙功能合成酶突變體是由氨基酸序列seqid?no.1所示的谷胱甘肽雙功能合成酶中的一個或多個氨基酸殘基位點發生突變形成的，其中，所述發生突變的氨基酸殘基位點包括第17位的異亮氨酸突變為組氨酸、第48位丙氨酸突變為半胱氨酸、第94位蘇氨酸突變為異亮氨酸、第123位精氨酸突變為苯丙氨酸以及第137位亮氨酸突變為絲氨酸。
7、作為本專利技術的優選方案，所述基因工程菌細胞b是以大腸桿菌e.coli?bl21(de3)為宿主，質粒pet-28a為表達載體，攜帶多聚磷酸激酶突變體基因形成的。
8、作為本專利技術的優選方案，所述多聚磷酸激酶突變體基因能夠編碼多聚磷酸激酶突變體。
9、作為本專利技術的優選方案，所述多聚磷酸激酶突變體是由氨基酸序列seq?id?no.3所示的多聚磷酸激酶中的一個或多個氨基酸殘基位點發生突變形成的，其中，所述發生突變的氨基酸殘基位點包括第27位的谷氨酸突變為亮氨酸、第38位纈氨酸突變為絲氨酸、第101位異亮氨酸突變為蘇氨酸、第122位甘氨酸突變為苯丙氨酸以及第237位亮氨酸突變為丙氨酸。
10、作為本專利技術的優選方案，所述粗酶液a是將所述基因工程菌細胞a的全細胞進行超聲或高壓勻漿破碎獲得的。
11、作為本專利技術的優選方案，所述粗酶液b是將所述基因工程菌細胞b的全細胞進行超聲或高壓勻漿破碎獲得的。
12、作為本專利技術的優選方案，催化反應的底物為dl-半胱氨酸、l-谷氨酸、甘氨酸、六偏磷酸鈉、atp和鎂離子。
13、作為本專利技術的優選方案，催化反應的底物dl-半胱氨酸可由化學法合成或消旋反應制得，也可由生物法制得，還可來源于dl-半胱氨酸或其鹽酸鹽的粗品。
14、谷胱甘肽雙功能合成酶突變體和多聚磷酸激酶突變體或表達谷胱甘肽雙功能合成酶突變體和多聚磷酸激酶突變體的基因工程菌在制備谷胱甘肽中的應用。
15、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是提供了一種高效、簡便、低成本制備d-半胱氨酸的新方法。
16、(1)本專利技術本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/L的L-谷氨酸鈉、5.4～8.0g/L的甘氨酸、14.2～20.6g/L的DL-半胱氨酸、1.3～1.8g/L的三磷酸腺苷和50～150g/L的六偏磷酸鈉的緩沖液為反應體系，加入具有谷胱甘肽雙功能合成酶突變體活性的基因工程菌細胞A或其粗酶液A和具有多聚磷酸激酶突變體活性的基因工程菌細胞B或其粗酶液B，在pH?7～9、30～45℃下反應，催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸生產谷胱甘肽，同時制得D-半胱氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌細胞A是以大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)為宿主，質粒pET-28a為表達載體，攜帶谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因形成的。
3.根據權利要求2所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因能夠編碼谷胱甘肽雙功能合成酶突變體。
4.根據權利要求3所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方
5.根據權利要求1所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌細胞B是以大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)為宿主，質粒pET-28a為表達載體，攜帶多聚磷酸激酶突變體基因形成的。
6.根據權利要求5所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突變體基因能夠編碼多聚磷酸激酶突變體。
7.根據權利要求6所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述多聚磷酸激酶突變體是由氨基酸序列SEQ?ID?NO.3所示的多聚磷酸激酶中的一個或多個氨基酸殘基位點發生突變形成的，其中，所述發生突變的氨基酸殘基位點包括第27位的谷氨酸突變為亮氨酸、第38位纈氨酸突變為絲氨酸、第101位異亮氨酸突變為蘇氨酸、第122位甘氨酸突變為苯丙氨酸以及第237位亮氨酸突變為丙氨酸。
8.根據權利要求1所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述粗酶液A是將所述基因工程菌細胞A的全細胞進行超聲或高壓勻漿破碎獲得的。
9.根據權利要求1所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和D-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述粗酶液B是將所述基因工程菌細胞B的全細胞進行超聲或高壓勻漿破碎獲得的。
10.谷胱甘肽雙功能合成酶突變體和多聚磷酸激酶突變體或表達谷胱甘肽雙功能合成酶突變體和多聚磷酸激酶突變體的基因工程菌在制備谷胱甘肽中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以含12.0～17.2g/l的l-谷氨酸鈉、5.4～8.0g/l的甘氨酸、14.2～20.6g/l的dl-半胱氨酸、1.3～1.8g/l的三磷酸腺苷和50～150g/l的六偏磷酸鈉的緩沖液為反應體系，加入具有谷胱甘肽雙功能合成酶突變體活性的基因工程菌細胞a或其粗酶液a和具有多聚磷酸激酶突變體活性的基因工程菌細胞b或其粗酶液b，在ph?7～9、30～45℃下反應，催化l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸生產谷胱甘肽，同時制得d-半胱氨酸。
2.根據權利要求1所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述基因工程菌細胞a是以大腸桿菌e.coli?bl21(de3)為宿主，質粒pet-28a為表達載體，攜帶谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因形成的。
3.根據權利要求2所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽雙功能合成酶突變體基因能夠編碼谷胱甘肽雙功能合成酶突變體。
4.根據權利要求3所述的一種雙酶偶聯制備谷胱甘肽和d-半胱氨酸的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽雙功能合成酶突變體是由氨基酸序列seq?id?no.1所示的谷胱甘肽雙功能合成酶中的一個或多個氨基酸殘基位點發生突變形成的，其中，所述發生突變的氨基酸殘基位點包括第17位的異亮氨酸突變為組氨酸、第48位丙氨酸突變為半胱氨酸、第94位蘇氨酸突變為異亮氨酸、第123位精氨酸突變為苯丙氨酸以及第...
【專利技術屬性】
技術研發人員：焦慶才，劉均忠，姚啟龍，楊春旋，王忠長，
申請(專利權)人：南京華輝天成生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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