無飼養細胞培養基和系統技術方案

本發明專利技術提供細胞培養基和系統，其消除或至少降低對飼養細胞的需求。所述細胞培養基包含通常由飼養細胞分泌和／或產生的一或多種因子和包含ＩＧＦ－Ｉ和一部分玻連蛋白的合成嵌合蛋白。所述細胞培養基特別適合用于增殖人胚胎干細胞和角化細胞。本發明專利技術還涉及利用培養于本發明專利技術的細胞培養基中的細胞的組合物和方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及細胞培養。更具體地，本專利技術涉及用于飼養細胞非依賴型細胞培養系 統的培養基、系統和方法。
技術介紹
人胚胎干(hES)細胞來源于胚囊(4-5天大的早期胚胎)的內層細胞團(ICM)。hES 細胞是多能細胞類型，其能夠產生三種主要的胚層，即外胚層、內胚層和中胚層[1，2]。換言 之，當給予必要的分化刺激時，這些細胞可發育成成人體內的超過200種細胞類型。或者， 當不給予分化刺激時，這些細胞將自我更新，產生多能子代細胞。有鑒于此，認為可以操縱hES細胞的多能行為以便更加有效地產生用于治療適應 癥的細胞和組織例如用于治療帕金森氏病[3]、糖尿病[4]或脊髓損傷[5]。不過，這些潛 在用途并不僅僅限于產生用于移植的組織。最近，已經操縱hES細胞形成特定組織類型以 便測試新的藥物和化合物[6]。可盡管有這些進展，在建立安全的培養方法之前，hES細胞 仍不具有治療活性。1998年首次成功實現對hES細胞的衍生化[1]。Thomson等(1998)發現，采用有 絲分裂滅活型飼養層和胎牛血清(FBS)可成功繁殖hES細胞。不過，使用異基因產物，例如 人或動物血清和小鼠成纖維細胞，可能會在培養系統中引入污染產物，例如牛綿狀腦病[7，8]。后來，還證明加入這些動物成分可引入免疫原性物(例如，N-羥乙酰神經氨酸，Neu5Ac) (Martin等2005 ；Heiskanen等2007)，提示生長于這些條件下，細胞的表型會受到微環境的 調控。顯然，需要建立改進的hES細胞培養方法，同時又能為hES細胞的體外擴增提供必要 的條件。有鑒于此，許多研究者在研究使用人飼養細胞，包括人包皮成纖維細胞[9，10]和 成人骨髓細胞[11]。已經證明這兩種細胞均支持hES細胞生長，由此可消除動物衍生的飼 養細胞造成污染的危險。不過，研究發現，經長期增殖后會出現分化率升高和異常核型[12，9]。例如，經細胞遺傳學分析，一些hES細胞出現非整倍型[12]，包括獲得染色體17q[13] 和20三體[14]。為解決這一問題，許多研究者一直嘗試建立完全每不含動物產物的hES細胞培養 條件。具體而言，Xu等(2005)鑒定到堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)信號對于hES細胞 自我更新是至關重要的[15]，而其他研究者則推測調變轉化生長因子(TGF)-i3信號途徑 對于防止默認分化是必需的[16]。后來，Ludwig等(2006)使用復雜蛋白質混合物和大量 的純化人血清白蛋白成功實現對hES細胞的物飼養細胞培養[17]。不過，這一研究發現，當 hES細胞培養數月后出現了 47XXY核型。盡管這已經取得了顯著的進步，但hES細胞的成功 增殖顯然仍需要飼養細胞。有趣的是，Xu等(2001)證實，來自小鼠胚胎成纖維細胞(MEF) 的條件培養基(CM)可支持hES細胞生長達130代倍增，而仍保持細胞的正常核型[18]。另一種需要依賴小鼠成纖維細胞飼養細胞才能存活并擴增的細胞類型是原代人 角化細胞。實際上，用于增殖hES細胞的許多培養技術，即血清和飼養細胞，均與角化細胞培養類似。已經證實，原代角化細胞需要依賴小鼠成纖維細胞飼養細胞才能進行體外非分 化擴增(Dawson 等 2006)。目前還不了解MEF對hES細胞培養物具有何種功能。不過已經證實這些飼養細胞 提供了多種對hES細胞以及角化細胞維持非分化狀態而言至關重要的蛋白質。
技術實現思路
現有細胞培養系統依賴于無有絲分裂活性的飼養細胞層為細胞生長和/或增殖 提供生長和條件因子，這些細胞培養系統在治療用途中具有嚴重的潛在缺陷。更具體地，使 用異基因產物可引入污染和感染因子，例如BSE和HIV。因此，本專利技術人認為需要一種新的改進的細胞培養系統，其能夠消除或至少降低 對飼養細胞的需求。不僅如此，本專利技術人出乎預料地發現，包含IGF-I氨基酸序列和成熟玻 連蛋白的第1至64位氨基酸殘基的合成嵌合蛋白在細胞培養基這展現出更高的活性，且特 別是能夠刺激細胞遷移和/或增殖達到高水平。寬泛而言，本專利技術涉及用于取代或替代飼養細胞的無血清非條件細胞培養基，其 包含一或多種分離的飼養細胞替代因子。預期所述一或多種分離的飼養細胞替代因子可以 是任何蛋白質或其生物學活性片段，其通常由飼養細胞分泌和/或產生，以促進飼養細胞 依賴型細胞的生長。在第一個方面，本專利技術提供細胞培養基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN) 氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養細胞替代因子人生長激素(hGH)、 骨形態發生蛋白15ΦΜΡ-15)、生長分化因子9(GDF-9)、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相關蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細胞生 長因子(HGF)、轉化生長因子-α (TGF-α)、轉化生長因子-β (TGF-β )、神經生長因子、 血小板衍生的生長因子-β (PDGF-β)，PC-衍生的生長因子(progranulin)、白細胞介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A(Activin-A)；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時 不能支持細胞的生長。優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一組hGH、BMP-15、 ⑶P-9、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生長抑制因子和激 活素-A。甚至更優選地，所述一或多種分離的飼養細胞替代因子是激活素-A。在優選的實施方式中，所述細胞培養基還包含選自以下一組的一或多種額外的生 物學活性蛋白堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、IGF-I、IGF-II和層 粘連蛋白。在更優選的實施方式中，所述一或多種額外的生物學活性蛋白選自bFGF和層粘 連蛋白。優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更優選地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在優選的實施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻連蛋白的第1至64位氨基酸殘基。優選地，所述合成嵌合蛋白還包含接頭序列，所述接頭序列為一或多個甘氨酸殘 基，且在特別優選的實施方式中，所述接頭序列還包含一或多個絲氨酸殘基。更優選地，所述接頭序列為(Gly4Ser)4t5在另一優選的實施方式中，所述細胞培養基還包含分離的含IGF的復合物，其中 IGF 選自 IGF-I 禾口 IGF-II。在另一優選的實施方式中，其中所述分離的含IGF的復合物包含IGF-I，所述細胞 培養基還包含胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)和VN。在另一優選的實施方式中，其中所述存在于所述分離的含IGF的復合物中的IGF 是IGF-II，所述細胞培養基還包含VN。優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約0. lng/ml和50 μ g/ml之 間。更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約5ng/ml和1500ng/ml之 間。甚至更優選地，所述或每一飼養細胞替代因子的終濃度在大約25ng/ml和 1000ng/ml 之間。進一步更優選地，所述或本文檔來自技高網...

【技術保護點】
細胞培養基，其包含：（ｉ）合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子（ＩＧＦ）氨基酸序列和玻連蛋白（ＶＮ）氨基酸序列；（ｉｉ）選自以下一組中的一或多種分離的飼養細胞替代因子：人生長激素（ｈＧＨ）、骨形態發生蛋白１５（ＢＭＰ－１５）、生長分化因子９（ＧＤＦ－９）、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白２、Ｗｎｔ－２ｂ、Ｗｎｔ－１２、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白（ＨＳＡ）、肝細胞生長因子（ＨＧＦ）、轉化生長因子－α（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、神經生長因子、血小板衍生的生長因子－β（ＰＤＧＦ－β）、ＰＣ－衍生的生長因子（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、白細胞介素（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３和激活素－Ａ；和（ｉｉｉ）不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏ＩＧＦ時不能支持細胞的生長。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】AU 2007-9-4 2007904793;AU 2008-2-27 2008900955細胞培養基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰島素樣生長因子(IGF)氨基酸序列和玻連蛋白(VN)氨基酸序列；(ii)選自以下一組中的一或多種分離的飼養細胞替代因子人生長激素(hGH)、骨形態發生蛋白15(BMP 15)、生長分化因子9(GDF 9)、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt 2b、Wnt 12、生長抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子 α(TGF α)、TGF β、神經生長因子、血小板衍生的生長因子 β(PDGF β)、PC 衍生的生長因子(progranulin)、白細胞介素(IL) 1、IL 2、IL 4、IL 6、IL 8、IL 10、IL 13和激活素 A；和(iii)不含血清或含有明顯減少量的血清，所述明顯減少量的血清在缺乏IGF時不能支持細胞的生長。2.權利要求1的細胞培養基，其中所述一或多種分離的飼養細胞替代因子選自以下一 組hGH、BMP-15,⑶P-9、巨核細胞集落刺激因子、分泌型卷曲相關蛋白2、Wnt_2b、Wnt_12、 生長抑制因子和激活素-A。3.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述一或多種分離的飼養細胞替代因子 是激活素-A。4.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述細胞培養基還包含選自以下一組的 一或多種額外的生物學活性蛋白堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、 IGF-I、IGF-II和層粘連蛋白。5.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述一或多種額外的生物學活性蛋白選 自bFGF和層粘連蛋白。6.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序 列或IGF-II氨基酸序列。7.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。8.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸殘基。9.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述合成嵌合蛋白還包含一或多個甘氨 酸殘基和一或多個絲氨酸殘基的接頭序列。10.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述接頭序列為(Gly4Ser)4t511.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其還包含分離的含IGF的復合物，其中IGF 選自 IGF-I 和 IGF-II。12.前述權利要求中任一項的細胞培養基，當IGF-II存在于所述分離的含IGF的復合 物中時，所述培養基還包含VN。13.前述權利要求中任一項的細胞培養基，當IGF-I存在于所述分離的含IGF的復合物 中時，所述培養基還包含IGFBP和VN。14.前述權利要求中任一項的細胞培養基，其中所述IGFBP選自以下一組IGFBP-1、 IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：Z厄普頓，D利弗斯利，SD理查茲，LB科馬克，D哈金，
申請(專利權)人：昆士蘭技術大學，
類型：發明
國別省市：AU[澳大利亞]