突變型DNA聚合酶及相關方法技術

公開了相對于相應的未經修飾的聚合酶具有改良的延伸速率的突變型ＤＮＡ聚合酶。突變型聚合酶能夠用于公開的多種引物延伸方法。還公開了相關的組合物，包括能夠用于，例如，突變型ＤＮＡ聚合酶產生的重組核酸、載體以及宿主細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及DNA聚合酶領域及它們的各種應用，包括核酸的引物延伸與擴增。專利技術背景DNA聚合酶負責基因組的復制和維護，這是在世代間精確傳遞遺傳信息的中心職責。DNA聚合酶在細胞中的功能是作為負責DNA合成的酶。它們在有金屬活化劑諸如Mg2+存在的情況下，以被復制的DNA模板或多核苷酸模板支配的順序聚合脫氧核糖核苷三磷酸。在體內，DNA聚合酶參與一系列DNA合成過程，包括DNA復制、DNA修復、重組和基因擴增。在每一DNA合成過程期間，復制DNA模板一次或最多幾次產生一致的復制品。與此相反，在體外，DNA復制可以重復多次，例如在聚合酶鏈式反應期間(參見例如Mullis的美國專利號4,683,202)。在聚合酶鏈式反應(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在DNA復制的每一循環開始時添加(參見上述美國專利號4,683,202)。后來，確認了從在高溫下生長的細菌中可獲得熱穩定DNA聚合酶，這些酶只需要添加一次(參見Gelfand的美國專利號4,889,818和Mullis的美國專利號4,965,188)。在PCR期間使用的高溫下，這些酶沒有不可逆失活。因此，可以進行聚合酶鏈式反應的重復循環而不需要在每一合成加成過程開始時添加新鮮的酶。DNA聚合酶特別是熱穩定聚合酶，是重組DNA研究和疾病的醫療診斷中大量技術的關鍵。特別是對于診斷應用，靶核酸序列可能僅僅是可疑DNA或RNA的一小部分，因此不擴增的話可能難以檢測到靶核酸序列的存在。由于DNA聚合酶在生物技術和醫學上的重要性，產生具有需要的酶性質例如改善的引物延伸速率、逆轉錄效率或擴增能力的DNA聚合酶突變體是非常有益的。聚合酶的總體折疊模式類似人的右手，包括手掌、手指和拇指三個獨特的亞結構域。(參見Beese等，Science?260：352-355，1993)；Patel等，BioChemistry?34：5351-5363，1995)。大小的細胞功能不同的聚合酶之間手指和拇指亞結構域的結構變化很大，而催化性的手掌亞結構域全-->部都是重疊的。例如，與引入的dNTP相互作用并在化學催化作用期間穩定過渡態的基序A是重疊的，在哺乳動物polα和原核的pol?I家族DNA聚合酶之間的平均偏差大約為1(Wang等，Cell?89：1087-1099，1997)。在結構上基序A以主要包括疏水性殘基的反向平行β鏈起始，延續到α-螺旋。DNA聚合酶活性位點的主要氨基酸序列是特別保守的?；駻的例子中，例如，序列DYSQIELR保留在從數百萬年進化的生物體包括例如水生棲熱菌(Thermus?aquaticus)、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)和大腸桿菌(Escherichia?coli)分離的聚合酶中。把這些觀察結果聯系在一起，它們指出聚合酶通過類似的催化機理行使功能。除了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位點也被證明是相對易變的，能夠接受特定的氨基酸取代而不顯著降低DNA聚合酶活性。(參見例如Patel等的美國專利號6,602,695)。這樣的突變型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反應的診斷和研究應用中提供各種選擇優勢。因此，在本領域需要鑒定氨基酸位點，所述氨基酸位點適于突變以產生改良的聚合酶活性，包括例如改良的延伸速率、逆轉錄效率或擴增能力。本專利技術，如同在此闡述的，滿足這些及其它需要。專利技術概述本專利技術提供相對于相應的未經修飾的聚合酶有改良酶活性的突變型DNA聚合酶，它可以用于多種核酸合成應用中。在一些實施方式中，聚合酶在聚合酶結構域中包含具有至少一個以下基序的氨基酸序列：a)Xa1-Xa2-Xa3-Xa4-R-Xa6-Xa7-Xa8-K-L-Xa11-Xa12-T-Y-Xa15-Xa16(SEQID?NO：1)；其中Xa1是I或L；Xa2是L或Q；Xa3是Q、H或E；Xa4是Y，H或F；Xa6是E、Q或K；Xa7是I、L或Y；Xa8是除Q、T、M、G或L之外的氨基酸；Xa11是K或Q；Xa12是S或N；Xa15是I或V；Xa16是E或D；b)T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N(SEQ?ID?NO：2)；其中Xb7是S或T；Xb8是除D、E或N之外的氨基酸；和c)Xc1-Xc2-Xc3-Xc4-Xc5-Xc6-Xc7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ?ID?NO：3)；其中Xc1是G、N或D；Xc2是W或H；Xc3是W、A、L或V；Xc4是除I或L之外的氨基酸；Xc5是V、F或L；Xc6是除S、A、V或G之外的氨基酸；和Xc7是A或L，-->其中聚合酶相對于Xa8是選自Q、T、M、G或L的氨基酸；Xb8是選自D、E或N的氨基酸和/或Xc6是選自S、A、V、或G的氨基酸而其它方面相同的聚合酶(即參考聚合酶)具有改良的核酸延伸速率和/或改良的逆轉錄效率。在參考聚合酶的一些實施方式中(例如Z05或CS5/CS6)，Xa8是Q、T、M、G或L，Xb8是D、E或N，Xc4是I或L，和Xc6是S、A、V、或G(SEQ?ID?NOS：23和24)。在參考聚合酶的一些實施方式中，Xb8是D、E或N(SEQ?ID?NOS：25和26)。對于基序a)Xa1-Xa2-Xa3-Xa4-R-Xa6-Xa7-Xa8-K-L-Xa11-Xa12-T-Y-Xa15-Xa16(SEQ?ID?NO：1)，在一些實施方式中，Xa8是選自由A、C、D、E、F、H、I、K、N、P、R、S、V、W、Y(SEQ?ID?NO：27)及其類似物組成的組的D-或L-氨基酸。在一些實施方式中，Xa8選自由R、K和N組成的組的氨基酸(SEQ?ID?NO：28)。在一些實施方式中，Xa8是精氨酸(R)(SEQ?ID?NO：29)。對于基序b)T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N(SEQ?ID?NO：2)，在一些實施方式中，Xb8是選自由A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y(SEQ?ID?NO：30)及其類似物組成的組的D-或L-氨基酸。在一些實施方式中，Xb8是選自由G、A、S、T、R、K、Q、L、V和I組成的組的氨基酸(SEQ?ID?NO：31)。在一些實施方式中，Xb8是選自由G、T、R、K和L組成的組的氨基酸(SEQ?ID?NO：32)。對于基序c)Xc1-Xc2-Xc3-Xc4-Xc5-Xc6-Xc7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ?IDNO：3)，在一些實施方式中，Xc4是選自由A、C、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種ＤＮＡ聚合酶，其在聚合酶結構域中包含至少一個選自由下列基序組成的組的基序：?。幔亍郏幔保荩亍郏幔玻荩亍郏幔常荩亍郏幔矗荩遥亍郏幔叮荩亍郏幔罚荩亍郏幔福荩耍蹋亍郏幔保保荩亍郏幔保玻荩裕伲? Ｘ↓［ａ１５］－Ｘ↓［ａ１６］（ＳＥＱＩＤ?。危希海保?；其中Ｘ↓［ａ１］是Ｉ或Ｌ；Ｘ↓［ａ２］是Ｌ或Ｑ；Ｘ↓［ａ３］是Ｑ、Ｈ或Ｅ；Ｘ↓［ａ４］是Ｙ、Ｈ或Ｆ；Ｘ↓［ａ６］是Ｅ、Ｑ或Ｋ；Ｘ↓［ａ７］是Ｉ、Ｌ或Ｙ；Ｘ↓［ａ８］是除Ｑ、Ｔ、Ｍ、Ｇ或Ｌ之外的其它氨基酸；Ｘａ１１是Ｋ或Ｑ；Ｘ↓［ａ１２］是Ｓ或Ｎ；Ｘ↓［ａ１５］是Ｉ或Ｖ；且Ｘ↓［ａ１６］是Ｅ或Ｄ；?。猓裕牵遥蹋樱樱亍郏猓罚荩亍郏猓福荩校危蹋眩危ǎ樱牛选。桑摹。危希海玻?；其中Ｘ↓［ｂ７］是 Ｓ或Ｔ；且Ｘ↓［ｂ８］是除Ｄ、Ｅ或Ｎ之外的其它氨基酸；和　ｃ）Ｘ↓［ｃ１］－Ｘ↓［ｃ２］－Ｘ↓［ｃ３］－Ｘ↓［ｃ４］－Ｘ↓［ｃ５］－Ｘ↓［ｃ６］－Ｘ↓［ｃ７］－Ｄ－Ｙ－Ｓ－Ｑ－Ｉ－Ｅ－Ｌ－Ｒ（ＳＥＱ　ＩＤ?。危希海常黄渲校亍郏悖保? 是Ｇ、Ｎ，或Ｄ；Ｘ↓［ｃ２］是Ｗ或Ｈ；Ｘ↓［ｃ３］是Ｗ、Ａ、Ｌ或Ｖ；Ｘ↓［ｃ４］是除Ｉ或Ｌ之外的其它氨基酸；Ｘ↓［ｃ５］是Ｖ、Ｆ或Ｌ；Ｘ↓［ｃ６］是除Ｓ、Ａ、Ｖ或Ｇ之外的其它氨基酸；且Ｘ↓［ｃ７］是Ａ或Ｌ，　其中該聚合酶相對于其中Ｘ↓ ［ａ８］是選自Ｑ、Ｔ、Ｍ、Ｇ或Ｌ的氨基酸；Ｘ↓［ｂ８］是選自Ｄ、Ｅ或Ｎ的氨基酸；且Ｘ↓［ｃ１］是選自Ｓ、Ａ、Ｖ或Ｇ的氨基酸，而其它相同的ＤＮＡ聚合酶具有改良的核酸延伸速率和／或改良的逆轉錄效率。...

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】US 2006-10-18 60/852,882;US 2007-7-13 60/949,7321.一種DNA聚合酶，其在聚合酶結構域中包含至少一個選自由下
列基序組成的組的基序：
a)Xa1-Xa2-Xa3-Xa4-R-Xa6-Xa7-Xa8-K-L-Xa11-Xa12-T-Y-Xa15-Xa16(SEQ
ID?NO：1)；其中Xa1是I或L；Xa2是L或Q；Xa3是Q、H或E；Xa4是Y、H或F；Xa6是E、Q或K；Xa7是I、L或Y；Xa8是除Q、T、M、
G或L之外的其它氨基酸；Xa11是K或Q；Xa12是S或N；Xa15是I或V；
且Xa16是E或D；
b)T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N(SEQ?ID?NO：2)；其中Xb7是S
或T；且Xb8是除D、E或N之外的其它氨基酸；和
c)Xc1-Xc2-Xc3-Xc4-Xc5-Xc6-Xc7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ?ID?NO：3)；
其中Xc1是G、N，或D；Xc2是W或H；Xc3是W、A、L或V；Xc4是除
I或L之外的其它氨基酸；Xc5是V、F或L；Xc6是除S、A、V或G之
外的其它氨基酸；且Xc7是A或L，
其中該聚合酶相對于其中Xa8是選自Q、T、M、G或L的氨基酸；
Xb8是選自D、E或N的氨基酸；且Xc1是選自S、A、V或G的氨基酸，
而其它相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率和/或改良的逆轉錄
效率。
2.權利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包含基序b)和c)，
而且Xb8是除D、E或N之外的其它氨基酸，且Xc6是除S、A、V或G
之外的其它氨基酸。
3.權利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包含基序a)、b)
和c)，而且
位點Xa8的氨基酸是R；
位點Xb8的氨基酸是G；
位點Xc4的氨基酸是F；且
位點Xc6的氨基酸是F。
4.權利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶與選自由下
列聚合酶組成的組的聚合酶具有至少90％的序列同一性：
(a)CS5?DNA聚合酶；
(b)CS6?DNA聚合酶；
(c)海棲熱袍菌DNA聚合酶；
(d)水生棲熱菌DNA聚合酶；
(e)嗜熱棲熱菌DNA聚合酶；
(f)黃棲熱菌DNA聚合酶；
(g)絲狀棲熱菌DNA聚合酶；
(h)棲熱菌種sps17?DNA聚合酶；
(i)棲熱菌種Z05?DNA聚合酶；
(j)那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶；
(k)非洲棲熱腔菌DNA聚合酶；
(l)Thermus?caldophilus?DNA聚合酶。
5.權利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是CS5?DNA
聚合酶或CS6?DNA聚合酶，而且第640位氨基酸選自由G、T、R、K
和L組成的組。
6.權利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是Z05?DNA
聚合酶，而且第580位氨基酸選自由G、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：KA鮑爾，ES史密斯，DH蓋爾芬德，E菲斯，S蘇科，
申請(專利權)人：霍夫曼拉羅奇有限公司，
類型：發明
國別省市：CH[瑞士]