突變Δ9延伸酶和它們在制備多不飽和脂肪酸中的用途制造技術

本文公開了具有將亞油酸[18:2，LA]轉化成二十碳二烯酸[20:2，EDA]和/或將α-亞麻酸[18:3，ALA]轉化成二十碳三烯酸[20:3，ETrA]的能力的突變Δ9延伸酶。本文還公開了分離的核酸片段和包含編碼突變Δ9延伸酶的此類片段的重組構建體，以及用這些突變Δ9延伸酶在含油酵母中制備長鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術屬于生物
更具體地，本專利技術涉及對編碼突變Λ9脂肪酸延伸酶的多核苷酸序列的創建以及這些延伸酶在制備長鏈多不飽和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。
技術介紹
人們正研究包括植物、藻類、真菌、原生藻菌和酵母在內的多種不同宿主作為商業化多不飽和脂肪酸[“PUFA”]生產的手段。基因工程已表明，一些宿主(即使那些天然限于亞麻酸[“υν”；18:2Ω-6]和α-亞麻酸[“ALA” ； 18:3 ω-3]脂肪酸生產的宿主)可進行實質上的改造以產生對多種長鏈《-3/co-6PUFA的高水平生產。無論這是天然能力還是重組技術的結果，花生四烯酸[“ARA”;20:4gj-6]、二十碳五烯酸[“ΕΡΑ”;20:5ω-3]、二十二碳五烯酸[“DPA”;22:5gj-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”;22:6co-3]可能均需要Λ 9延伸酶基因的表達。特化的Λ 9延伸酶具有將LA轉化成二十碳二烯酸[“EDA”;20:2 ω -6]，以及將ALA轉化成二十碳三烯酸[“ETrA”；20:3co-3]的能力。然而，僅僅鑒定出少量的Λ9延伸酶。這些酶包括來自綠光等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9延伸酶[“IgD9e”] (SEQ IDNO:1 和 2 ；PCT 公開 W02002/077213、W02005/083093, W02005/012316 和 W02004/057001 ；GenBank登錄號AAL37626、來自小型綠藻屬(Eutr印tiella sp.) CCMP389的Λ9延伸酶[“E389D9e”] (SEQ ID NO: 3 和 4 ;美國專利 7，645，604)、來自小眼蟲(Euglena gracilis)的 Λ9 延伸酶[“EgD9e”] (SEQ ID NO:7 和 8 ;美國專利 7，645，604)、以及來自 Euglenaanabaena 的 Λ 9 延伸酶[“EaD9e”] (SEQ ID NO: 11 和 12 ;美國專利 7，794，701)。盡管美國專利7，645，604鑒定出在EgD9e、E389D9e和IgD9e延伸酶之間保守的七種基序，但是僅僅使用IgD9e進行了一項研究來鑒定對于Λ9延伸酶功能性而言重要的氨基酸殘基(Qi，B.等,FEBS Lett.,547:137-139 (2003))。不存在來自△ 9延伸酶的可用晶體結構以指導對所述蛋白質的基因進化，并且對于△ 9延伸酶序列、結構和功能之間的關系了解甚少。盡管缺乏了解，對于在能夠制備PUFA的生產宿主細胞中以高酶活性進行有效表達的△ 9延伸酶基因仍然存在需求。已經發現了良好地適用于在商業可用的宿主細胞中整合進入PUFA生物合成途徑的具有高活性的新型Λ9延伸酶突變體。令人驚異并且出乎意料的是，據發現，特定的點突變產生了 Λ 9延伸酶突變體，所述Λ 9延伸酶突變體的酶活性基于LA向EDA的轉化是野生型酶的96%至145%。
技術實現思路
在第一實施例中，本專利技術涉及分離的多核苷酸，其包含:(a)編碼突變多肽的核苷酸序列，所述突變多肽具有Λ 9延伸酶活性且具有如SEQID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID Ν0:22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所述突變選自:i)L35F 突變；ii)L35M 突變；iii)L35G 突變；iv)L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、W132T 和 I179R 突變;vi) L35G、S9D、Y84C 和 1179R 突變；vii)L35G、A21V、L108G 和 I179R 突變；viii)L35G、Y84C、I179R 和 Q244N 突變；ix)L35G、A21V、W132T、I179R 和 Q244N 突變；X) K58R 和 I257T 突變；xi)D98G 突變；xii)L130M 和 V243A 突變；以及xiii)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y 和 I257T ；(b)部分(a)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成且是100%互補的。所述分離的多核苷酸可具有選自下列的核苷酸序列:SEQ ID NO:28, SEQ IDN0:31、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:58,SEQ ID N0:61、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQID NO:106 和 SEQ ID NO:109。在第二實施例中，本專利技術涉及具有Λ9延伸酶活性的突變多肽，所述突變多肽由權利要求1的分離的多核苷酸編碼。所述突變多肽可具有選自下列的蛋白質序列:SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO: 10USEQ ID NO: 104,SEQ ID NO: 107 和 SEQ ID NO: 110。在第三實施例中，所述突變多肽具有Λ 9延伸酶活性，所述Λ 9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO: 10所示的多肽的Λ 9延伸酶活性。優選地，當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比為至少110% (B卩，對應于至少10%的活性改善)，并且更優選地，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比為至少120%(SP，對應于至少20%的活性改善)。在第四實施例中，本專利技術涉及重組構建體，其包含權利要求1的分離的多核苷酸，所述重組構建體可操作地連接至少一種調控序列。在第五實施例中，本專利技術涉及轉化的細胞，其包含本專利技術的分離的多核苷酸。所述轉化的細胞可優選地選自植物、細菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌、卵菌和真菌。在第六實施例中，本專利技術涉及轉化的含油酵母，所述含油酵母產生其干細胞重量 的至少約25%的油，所述含油酵母包含(a)至少一種重組DNA構建體，其包含本專利技術的分離的多核苷酸；以及(b)至少一種重組DNA構建體，其包含可操作地連接至少一種調控序列的分本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.08.26 US 61/377,2481.分離的多核苷酸，包含: (a)編碼突變多肽的核苷酸序列，所述突變多肽具有Λ9延伸酶活性且具有如SEQ IDNO: 22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO: 22與SEQ ID NO: 10具有至少一個氨基酸突變的差異，所述突變選自: i)L35F突變； ii)L35M突變； iii)L35G突變； iV) L35G突變和至少一種選自下列的其它突變:S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、1179M、1179R、C236N、Q244N、A254W 和 A254Y ；v)L35G、A21V、L108G和 I179R 突變；vi)L35G、W132T和 1179 突變；vii)L35G、S9D、Y84C和 I179R 突變；viii)L35G、Y84C、I179R和 Q244N 突變；ix)L35G、A21V、W132T、I179R和 Q244N 突變；x)K58R 和 I257T 突變； xi)D98G突變； xii)L130M和V243A突變；以及 i)包含至少兩種突變的任何組合，其中所述突變選自:K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S91、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W.A254Y 和 I257T ； (b)部分(a)的核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和所述核苷酸序列由相同數量的核苷酸組成且是100%互補的。2.根據權利要求1所述的分離的多核苷酸，其中所述核苷酸序列選自:SEQID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO: 100, SEQ IDNO:103、SEQ ID NO:106 和 SEQ ID NO:109。3.具有Λ9延伸酶活性的突變多肽，所述突變多肽由權利要求1的分離的多核苷酸編碼。4.根據權利要求3所述的突變多肽，其中蛋白質序列選自:SEQID NO:29, SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:87,SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107 和 SEQ ID NO:110。5.根據權利要求3或4中任一項所述的突變多肽，其中所述Λ9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO: 10所示的多肽的Λ9延伸酶活性。6.根據權利要求5所述的突變多肽，其中當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比為至少110%。7.根據權利要求6所述的突變多肽，其中當與如SEQID NO: 10所示的多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比相比時，所述突變多肽的亞油酸向二十碳二烯酸的底物轉化百分比為至少120%。8.重組構建體，包含權利要求1的分離的多核苷酸，所述重組構建體可操作地連接至少一種調控序列。9.轉化的細胞，包含權利要求1的分離的多核苷酸。10.根據權利要求9所述的轉化的細胞，其中所述細胞選自:植物、細菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌、卵菌和真菌。11.根...

【專利技術屬性】
技術研發人員：MW博斯蒂克，H何，Y李，Q朱，
申請(專利權)人：納幕爾杜邦公司，
類型：
國別省市：