穩定的生長激素化合物制造技術

本發明專利技術涉及生長激素(GH)化合物，所述化合物具有額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變，使得所述化合物具有蛋白水解性降解抗性。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及抗蛋白水解性降解的穩定的生長激素(GH)化合物。
技術介紹
生長激素(GH)是一種由哺乳 動物垂體前葉分泌的多肽激素。依物種而定，GH是一種由大約190個氨基酸殘基組成的蛋白質，對應分子量約為22 kDa。GH與細胞表面受體即GH受體(GHR)結合，并通過GH受體發出信號。GH在促進生長、保持正常身體組成、合成代謝和脂質代謝中起關鍵作用。它還對中間代謝具有直接作用，例如葡萄糖攝取降低、脂解作用(Iipolysis)增加、氨基酸攝取和蛋白質合成增加。該激素還對其它組織發揮作用，包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結締組織和肌肉。重組hGH已有生產且可市售獲得，例如Genotropin (Pharmacia Upjohn)、Nutropin 和 Protropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly) > Serostim (Serono)、諾地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外,在N末端具有額外甲硫氨酸殘基的類似物還以例如 Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)銷售。GH與蛋白質GH家族的其它成員催乳素(PRL)和胎盤催乳激素(PL)有共同的拓撲結構。GH被歸類為4螺旋束蛋白質(圖I)，顯示具有兩個保守的二硫鍵的“上-上-下-下(up-up-down-down) ”拓撲結構。具體而言,野生型人GH (hGH)由191個氨基酸殘基組成，并在53、165、182和189位上具有4個半胱氨酸殘基，其通過形成分別連接C53與C165和C182與C189的2個分子內二硫鍵而穩定蛋白質的三維結構(圖I)。通過X射線晶體學實驗性地測定了以下的hGH結構游離形式(Chantalet L.等(1995) Protein and PeptideLetters 3,333-340)和與其結合蛋白(人GHR (hGHR)的胞外結構域)的復合物(Devos，A. M.等(1992) Science 255,306-312)。這些結構已保藏在蛋白質數據庫(PDB)中，并且是可公開獲取的(PDB登錄代碼分別為IHGU和1HWG)。因此，根據已發表的hGH結構，可鑒定出對于hGH與hGHR結合重要的殘基。此外，通過核磁共振(NMR)波譜術研究了 hGH的動力學特性(Kasimova M. R.等.J. Mol. Biol. (2002) 318,679-695)。聯合地，X 射線和NMR數據可區分結構化良好和定義明確的hGH的區域與結構化較少并且是動態的區域。預期hGH的較少結構化的動態區特別易遭蛋白酶剪切，該區域的適當穩定可導致蛋白水解穩定性改進。已對hGH進行大量誘變以試圖產生具有所需化學或生物性質的hGH類似物。具體而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突變體。US 2003/0162949公開了 GH超基因家族成員的半胱氨酸變體。提供用于產生這些蛋白質的位點特異性的生物活性綴合物的通用方法。所述方法包括將半胱氨酸殘基加到蛋白質的非必需區或采用定點誘變用半胱氨酸殘基取代蛋白質中的非必需氨基酸，然后通過所加入的半胱氨酸殘基，將半胱氨酸反應性聚合物或其它類型的半胱氨酸反應性部分與蛋白質共價偶聯。WO 02/055532描述了遺傳工程改造的具有至少一個共價連接的非多肽部分的hGH突變體，特別是其中所引入的半胱氨酸殘基被用于聚乙二醇化的hGH突變體。US 5,951,972描述了有生理活性的衍生化天然和重組的哺乳動物和人蛋白質和多肽，其中蛋白質內至少一個天然存在的或摻入的半胱氨酸殘基用各種取代基衍生化。詳細研究了 hGH的蛋白酶剪切。由殘基128-154組成的長環具有例如以下幾種蛋白酶的推定的切割位點凝血酶、纖維蛋白溶酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。因此，該部分的hGH顯示特別易受蛋白酶剪切影響(Lewis,U. J. Ann.Rev. Physiol. (1984.) 46，33_42)。已報道的降解hGH的酶包括凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和激肽釋放酶。已對大鼠組織中的hGH降解進行了研究(Garcia-Barros等.J. Endocrinol.Invest. (2000) 23,748-754)。發現在大鼠甲狀腺中，有利于在大型和親脂性氨基酸殘基處切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶首先切割Y143和S144之間的肽鍵，產生2鏈分子，接著在Y42和S43之間切割，釋放N端肽F1-Y42。再通過胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶在F146和D147之間切割并再通過羧肽酶的作用，加工2鏈分子中的裂解環(split loop) o 已報道了產生對蛋白水解性降解穩定的hGH類似物的幾種方法。Alam等人(J. Biotech. 65,183-190 (1998))通過特異性點突變，設計了抗凝血酶和纖維蛋白溶酶的hGH突變體。凝血酶特別在R134和T135之間切割hGH，雙重突變體R134D, T135P產生抗凝血酶切割的hGH變體，而三重突變體R134D，T135P, K140A產生纖維蛋白溶酶抗性。此外，后一種hGH突變體具有在7天時間內抗人血漿蛋白酶解的抗性。EP534568描述了通過使R134突變成丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或組氨酸而對蛋白水解性降解穩定的hGH突變體。W02004022593/Nautilus描述了通用的高通量定向進化方法，以產生蛋白水解穩定性提高的修飾細胞因子(包括GH變體)。W02006048777/Nautilus特別描述了蛋白水解穩定性改進的修飾的hGH類似物。類似物在 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1_5個突變。半胱氨酸殘基的引入可能導致形成不需要的二硫鍵連接的二聚體，在W02006048777的范圍明確不包括氨基酸殘基被半胱氨酸取代；在102006048777 (第65頁)中闡述“明確避免氨基酸被半胱氨酸殘基置換，因為這種改變可能導致形成分子間二硫鍵”。顯然需要開發抗蛋白水解性降解的hGH化合物。這種穩定化合物對蛋白酶剪切應顯示出提高的穩定性，同時保持所需的hGH的生物學性質。這種GH分子應提高穩定性、降低清除率和/或延長體內半衰期。此外，蛋白質治療劑通常需要靜脈內或皮下給予，因為其通常不能通過口服而充分利用。蛋白質口服生物利用度低部分是由于胃腸道中的蛋白水解性降解所致。因此，還需要開發可以口服給予以治療hGH相關病癥的hGH化合物。專利技術概述 本專利技術涉及生長激素化合物，所述化合物與人生長激素相比，包含一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。在本專利技術的GH化合物中，通過將野生型hGH序列中的至少一個氨基酸突變成半胱氨酸而引入至少一個額外的半胱氨酸殘基。在本專利技術的GH化合物中，以一定方式選擇一個或多個突變位點，使得(I)將所引入的一個或多個半胱氨酸殘基適當置本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.01.22 EP 10151405.7;2010.01.22 US 61/297305;21.生長激素化合物，所述化合物與由SEQID NO I限定的人生長激素(hGH)相比，包含一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。2.權利要求I的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個連接環區段與螺旋區段的額外的二硫鍵。3.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應于 SEQ ID NO I 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。4.權利要求1-3中任一項的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個額外的二硫鍵，其中其至少一個半胱氨酸存在于對應于SEQ ID NO I的AA 128-154的環3 (L3)中。5.權利要求4的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個連接L3與螺旋2 (H2)或環I (LI)的額外的二硫鍵。6.權利要求3的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應于 SEQ ID NO I 中的 H21C/M170、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58...

【專利技術屬性】
技術研發人員：H德穆特，CBS希奧特，L諾斯科夫勞里森，J陳，P泰格森，
申請(專利權)人：諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司，
類型：
國別省市：