使用過氧化物氧化還原酶1(PRX1)作為佐劑的方法和組合物技術

本發明專利技術提供用于激發針對抗原的免疫反應的組合物和方法。該組合物包括抗原和分離的Prx1蛋白，該抗原激發所需要的免疫反應。Prx1蛋白作為佐劑起作用以使這種包含抗原與Prx1的組合物激發的對該抗原的免疫反應強于僅用該抗原激發的免疫反應。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術總體上涉及免疫治療領域，更明確而言，本專利技術涉及使用Prxl作為佐劑來增強針對抗原的免疫反應。 _4]
技術介紹
Prxl是典型的2-半胱氨酸過氧化物氧化還原酶家族的ー員，其主要的胞內功能是通過其過氧化物酶的活性作為過氧化氫信號通路的調控因子和作為蛋白質的伴侶蛋白。Prxl的表達在各種癌癥中會上調，包括食管癌、胰腺癌、肺癌、甲狀腺濾泡癌和口腔癌。PrxI水平的升高與臨床結果不理想和病人整體存活情況降低相關。最近的研究證實Prxl可以由非小細胞肺癌細胞分泌，該分泌可能通過ー種非經典的分泌途徑。然而，分泌的Prxl的作用至今尚未知曉，之前也未就治療目的加以探索。
技術實現思路
本專利技術提供了用于激發免疫反應的組合物和方法。這種組合物包括抗原和分離的Prxl蛋白。抗原和Prxl蛋白可以以復合物的形式提供，或者它們可以彼此共價連接。Prxl蛋白在復合物中可以以多聚體的形式存在。在一個實施方式中，所述多聚體是十聚體。組合物還可以包括接觸過抗原和/或Prxl蛋白的抗原呈遞細胞。抗原可以是用于激發所需要的免疫反應的任何抗原，包括但不限于傳染源或癌細胞表達的抗原。在一個實施方式中，抗原由腫瘤細胞表達。在個體中激發針對抗原的免疫反應的方法包括給予該個體包含該抗原和分離的Prxl蛋白的組合物。所激發的免疫反應可強于該抗原在不給予分離的Prxl蛋白時所激發的免疫反應。激發的免疫反應可包括細胞介導的免疫反應、體液免疫及其組合。在一個實施方式中，激發針對抗原的免疫反應的個體是有風險發生、被懷疑患有或已經診斷患有癌癥的個體。附圖簡要說明圖I. Prxl刺激巨噬細胞分泌細胞因子(A)采用流式細胞儀檢測TG誘出的巨噬細胞所表達的⑶llb、Grl和F4/80。示出3次獨立分離的代表性柱狀圖，顯示⑶Ilb+細胞的Grl和F4/80的表達情況。插入框中的數字表明是每個象限中CDllb+細胞的百分比。(B)將TG誘出的巨噬細胞和刺激物共同培養24小吋，收獲上清液后分析TNF- α (空心柱)和IL-6 (灰色柱)的水平。結果以pg/ml為單位，代表了三組獨立試驗，誤差線代表標準差。(C)將TG誘出的巨噬細胞分別如下培養24小時僅用培養基(黑色柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl (空心柱)；用IOOnM LPS或2000nM Prxl，經lOug/mL多粘菌素B預孵育20分鐘(陰影線柱)；100nM LPS或變性的2000nM Prxl (灰色柱)。星號表示與僅用Prxl或LPS處理過的細胞相比p彡O. 01。(D)將TG誘出的巨噬細胞分別以單獨的培養基、Prxl (50nM)或LPS(IOOnM)培養24小時，灰色柱表示培養時添加10%的FBS，空心柱表示未添加10%的FBS。收獲上清液，并分析IL-6的水平。結果以pg/ml為單位，誤差線代表標準差。圖2. Prxl刺激樹突狀細胞的成熟與激活。(A和B)將未成熟的骨髓來源的樹突狀細胞(iBMDC)分別以單獨的培養基、20-200nM Prxl或IOOnM LPS培養24小時。(A)培養后，通過流式細胞儀分析細胞中⑶Ilc和⑶86的表達情況。結果顯示為占所有細胞的百分比，誤差線代表標準差。(B)收獲上清液，并對TNF-α進行分析。結果以pg/ml為單位，代表三組獨立實驗，誤差線代表標準差。(C)將TG誘出的巨噬細胞與如下培養基共同培養收獲自培養轉染有編碼對照shRNA (亂序，Scramble)或Prxl特異性shRNA (shPrxl)的cDNA的前列腺腫瘤細胞系的培養基，或者是收獲自培養表達Prxl特異性shRNA的細胞的培養基(其中添加了 50nM外源性的Prxl，shPrxl+Prxl)。培養24小時后收獲上清液，對TNF-α進行分析。結果以Pg/ml為單位，代表三組獨立試驗，誤差線代表標準差。 林P彡O. 01，與僅用培養基培養的細胞所分泌的TNF- α水平相比;## P ^ 0.01,與用獲自表達對照shRNA的細胞的培養基培養的細胞所分泌的TNF- α水平相比 PS0.0丨，與用獲自表達Prxl特異性ShRNA的細胞的培養基培養的細胞所分泌的TNF-α水平相比。圖3. Prxl誘導的細胞因子分泌依賴于TLR4。(A)從 C57BL/6 小鼠(TLR4+/+;空心柱)和 C57BL/10ScNJ 小鼠(TLR4+ ;實心柱)分離得到iBMDC，分別用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmM Pam3Cys激發。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。(B)從C57BL/6小鼠(TLR4+/+;空心柱)和C57BL/10ScNJ小鼠(TLR4+;實心柱)分離得到TG誘出的巨噬細胞，分別用200nM PrxlUOOnM LPS或IOOmMPam3Cys激發。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。結果以pg/ml為單位；誤差線代表標準差，星號表示P值小于O. 01。(C)向未處理的C57BL/6(TLR4+/+;空心柱)小鼠和C57BL/10ScNJ(TLR4^;實心柱)小鼠腹腔內注射200nm的Prxl。6小時后，采集血樣，用ELISA分析IL-6的存在。結果以pg/ml為單位；誤差線代表標準差，星號表示P彡O. 0002。圖4 =Prxl和TLR4的相互作用依賴于CD14和MD2。(A)從C57BL/6小鼠中分離得到TG誘出的巨噬細胞，在存在或不存在對照或針對Prxl、CD14或MD2的封閉抗體的情況下用50nM Prxl刺激24小吋。收集上清液，用IL-6ELISA試劑盒分析。結果以pg/ml為單位；誤差線代表SEM，星號表示P值小于O. 01。(B)收獲TG誘出的巨噬細胞，如材料和方法中所述，用針對TLR4、TLR2和小鼠/山羊IgG的抗體沉淀細胞裂解物；所得沉淀物經SDS-PAGE分離并通過蛋白質印跡分析檢測Prxl的存在。還用TLR4或TLR2的抗體檢測印跡以作為內參照。(C)收獲TG誘出的巨噬細胞，如材料和方法中所述，將細胞裂解物與針對TLR4或小鼠/山羊IgG的抗體共孵育；所得沉淀物經SDS-PAGE分離并通過蛋白質印跡分析檢測Prxl、⑶14和MD2的存在。還用TLR4抗體檢測印跡以作為內參照。圖5 :TLR4/Prxl相互作用的動力學。(A) TG誘出的巨噬細胞經200nM的FITC-Prxl或PE連接的抗TLR4(PE-TLR4)激發。在指定的時間收集樣品。樣品和細胞群體通過安尼斯(Amnis)技術分析。圖示為在每個時間點下，代表性的免疫染色細胞和兩種染色合并后的圖像。最右邊的柱狀圖為通過所分析的每個細胞的像素統計分析(n=5，000)得出的像素柱狀圖，其中y軸表示的是細胞的數目，X軸表示的是Prxl和TLR4之間的相似系數。(B)圖示為每個時間點所有細胞的平均相似系數；誤差線表示標準差。圖6. Prxl結合TLR4是結構依賴性。(A)從TLR4+/+(白色柱)或TLR4+巨噬細胞(實心柱)中分離得到TG誘出的巨噬細胞，然后分別與培養基(無添加)、200nM的Prxl、200nM的PrxlC52S或200nM的PrxlC83S培養24小時，收獲上清液，分析TNF- α和IL-6的存在。⑶從TLR4+/+(白色柱)本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2009.12.08 US 61/267,6471.一種組合物，其包含抗原和分離的過氧化物氧化還原酶I(Prxl)蛋白。2.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述抗原是腫瘤抗原。3.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述Prxl蛋白和所述抗原以復合物的形式存在。4.如權利要求I所述的組合物，其還包含抗原呈遞細胞。5.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述抗原呈遞細胞是樹突狀細胞、巨噬細胞或其組合。6.如權利要求I所述的組合物，其特征在于，所述分離的Prxl蛋白以Prxl十聚體的形...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S·O·戈爾尼克，J·里德爾，
申請(專利權)人：健康研究股份有限公司，
類型：
國別省市：