本發明專利技術涉及一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，1）確定研究所需基因組片段長度；2）對選定的基因組片段進行修飾；3）將修飾后的基因組片段進行大量擴增純化，并運用轉基因手段將修飾后的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，分別形成轉基因細胞或轉基因動物：4）對轉基因細胞或轉基因動物施以特定刺激；5）從刺激后的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白；6）分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列；本發明專利技術提供了一種能夠高效篩選參與指定基因或遺傳位點表達調控相關蛋白及其結合位點的高特異性，高靈敏性研究方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學領域，涉及一種篩選基因調控相關機制和分子的研究方法，尤其涉及一種。
技術介紹
真核基因調控，是一種將蘊藏在DNA序列中的遺傳信息，顯現為有功能的蛋白質或核酸，進而參與各項生命活動的過程。這一過程要求基因組內各基因按特定的次序在特定的時間，空間，以適當的形式和數量進行表達。基因表達調控是生命得以維持和延續的前提。雖然人們對原核基因的表達調控已經有了比較深入的了解，但由于真核基因本身結構 和功能極為復雜，又缺乏有效的研究手段和技術，雖經多年巨大的努力，但相關研究的進展仍極為緩慢。時至今日，人們對真核基因的表達調控，依然所知甚少。真核基因是斷裂基因，包括能夠編碼蛋白質序列的外顯子和非編碼的內含子序列以及非編碼的調控序列。外顯子能夠經過翻譯過程生成蛋白質，調控序列則結合相關的調控因子。在人類基因組內，編碼外顯子的序列僅占全序列的1%左右，非編碼序列中，內含子占24%，剩余的75%為非編碼的各種調控序列和大量重復序列。基因的平均長度為27kb，85%的基因長度小于lOOkb。就基因表達調控而言，每一特定基因的表達調控都可以單獨進行。基因調控過程中，轉錄調控是最關鍵的環節。特定基因的轉錄調控是通過不同的轉錄因子與參與該基因調控的相關序列相結合來實現的。這些調控序列被稱為順式作用元件，與其結合的轉錄分子稱為反式作用因子。順式作用元件包括啟動子，增強子，沉默子等。除啟動子一般位于緊鄰基因的上游之外，其他作用元件可以位于基因的上下游，位置無法預測。同特定基因啟動子相結合的是RNA聚合酶和相關蛋白，這些因子決定該基因轉錄的起始。同特定基因增強子相結合的是組織特異性轉錄因子，決定該基因在某類組織和細胞內的表達水平。某一特定基因的表達都是多種轉錄因子和不同調控序列相結合結果。在人類基因組內，能夠參與基因表達調控，擁有DNA結合區段的蛋白編碼基因有2600多種。這些轉錄因子之間可以發生復雜的相互作用，轉錄因子連同與它們相結合的調控序列共同構成了一個龐大基因調控網絡。核酸內切酶是一類能夠識別雙鏈DNA上某段特定核酸序列的核酸酶。這些特定的核酸序列被稱之為該核酸內切酶的酶切位點。不同的核酸內切酶擁有各自不同的特異性的酶切位點。當某一核酸內切酶同DNA上其特異性酶切位點結合后，在適當的條件下，可以在該識別位點切斷雙鏈DNA。不同核酸內切酶的酶切位點長度和序列不同。當酶切位點的長度增加時，其在基因組內的識別位點的數量會變得稀少。當識別位點長度超過一定限度后，其識別位點的數量可以稀少到一套完整的基因組內也沒有一個的程度。例如，當酶切位點長度為18bp時，隨機出現一個識別位點的DNA長度為418bp，這是人類基因組的20倍。極稀少位點核酸酶是一類特殊的核酸內切酶，它們的酶切識別位點序列長度一般在IObp以上。其中，兆位核酸酶(meganuclease)是一類識別位點長度在12_40bp的極稀少位點核酸酶。目前已經從多種生物體內發現了數百種兆位核酸內切酶,并且新的兆位核酸酶數量還在不斷增加。由于兆位核酸酶在每種生物的基因組內的識別位點極為稀少，這就為高特異性，高選擇性的定向基因操作(包括基因治療，遺傳育種)等研究領域提供了廣闊的應用前景。通過分析這些兆位核酸酶的結構特點，研究者們已經成功制備出經人工改造過的兆位核酸酶。這些人工兆位酶幾乎能夠識別任意特定的核酸序列。同時，已經有商品化的純化兆位核酸酶在市場出售。由于基因組內絕大多數基因的長度都小于lOOkb，當包含某一基因的基因組片段足夠長時，該片段的長度就可以包含該基因的完整編碼序列和參與調控該基因表達的所有調控元件。在基因組計劃中發展起來的大容量基因組載體庫已經能夠提供包含絕大多數基因完整序列的特定克隆，其中，Pl人工染色體(PAC)和細菌人工染色體(BAC)能夠容納長達100-300kb的基因組片段，酵母人工染色體(YAC)可容納500kb-lMb的基因組片段。利用這 些載體構建的基因組文庫已經實現了商品化，任何一段基因組序列，幾乎都能夠檢索到相應的載體克隆。目前，對這些大容量基因組載體內的基因組大片段進行定點突變，插入，刪除等多項操作的分子生物學技術已經成熟，改建好的載體能夠在體外大量擴增，從而可以方便的獲得修飾后的基因組片段，與此相關的技術服務已經實現商品化運作。近年來，生物合成技術的進步已經使得人們能夠對多個DNA片段進行有序的拼接，這些片段可以是PCR的產物，整個拼接過程均可以在體外完成，效率極高。利用這些拼接技術，能夠很容易的向合成的DNA片段內加入特定的序列，從而避免了繁瑣的克隆篩選過程。應用這一技術，已經能夠生成500kb以上的基因組片段，進行DNA拼接的生物合成相關試劑目前也已經實現了商品化。轉基因技術的發展已經能夠利用多種技術向細胞內導入大容量基因組載體，制備出含有基因組大片段的轉基因細胞系或動物。同傳統的小片段轉基因相比，利用基因組大片段進行的轉基因研究，能夠向細胞內轉入特定基因表達調控所需要的全部調控元件，這使得轉入基因的表達能夠同內源性基因一樣受到同步調控，其表達狀態直接反映出內源性基因的調控狀態，同時其表達水平不受插入位點的影響，僅同轉入基因的數量同關。在基因組內，由于不同基因的表達是細胞內外多種因素作用的結果，因此反式作用因子同順式調控元件的結合多是暫時性的，這使得基因表達的調控具有靈活性，但同時也增加了分析的難度。在基因調控研究中，為了能夠捕捉到這些短暫的轉錄因子同DNA的相互作用，通常要采用交聯劑將蛋白和核酸固定在一起，再進行分離分析的手段。交聯劑可以是物理上的電離輻射，紫外光照射，也可以是化學試劑，種類很多。交聯劑將DNA和與其結合的轉錄因子交聯在一起，經分離后，可以運用多種蛋白組，生化和分子生物手段分析參與基因調控的蛋白種類和相關調控元件的序列。由于體外研究的許多結果無法真實的反應體內的情況，人們迫切需要一種能夠對體內基因調節進行研究的手段。當前能夠直接檢測體內同DNA相結合的蛋白的研究方法主要是染色質免疫沉淀法(CHIP)。這種方法首先用交聯劑將DNA和與其結合的蛋白質交聯固定，再用核酸酶消化法或超聲粉碎法將染色質隨機斷成小片段，再采用能夠特異性識別DNA結合蛋白的抗體，捕捉交聯后的相應的片段。通過分析獲得片段的序列，并與基因組序列進行比對，就能夠確定在整個基因組內，與某類蛋白相結合所有調控序列所在的位置，提示其可能參與基因調控的種類和數量。這種方法只能應用在對全基因組的分析上，無法給出參與特定基因調控的相關蛋白情況。另一種分離染色質片段的蛋白組(PICH)方法，通過設計出與特定基因序列相結合的DNA探針，再利用探針對交聯后的全基因組片段進行多輪反復的雜交，通過特異性的探針結合相應的基因組片段，分離出能夠同特定基因片段相結合的所有蛋白。由于每一個基因在單一細胞內僅有兩個等位基因，為了能夠從復雜的基因組片段內成功的提取出所需的基因片段，PICH方法要求的材料數量很大，一次實驗的細胞數高達IO9以上，培養細胞可達上百升，這對絕大多數細胞實驗而言都很困難，因此這一方法僅在端粒結合蛋白中進行了驗證。CHIP和PICH這兩種方法代表了不同的研究策略，但在分析的過程中，都要將細胞勻漿，使得基因組斷成小片段，再運用抗體或核酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：1）通過查找基因組數據庫和相關載體庫，找到包含有目的基因或基因組位點的完整基因組序列，并根據以往對該基因或基因位點的相關研究，確定所需基因組片段長度，所述所需基因組片段長度的范圍在100kb？300kb之間；2）對步驟1）所選定的基因組片段進行修飾，得到修飾后的基因組片段；3）將步驟2）所得到的修飾后的基因組片段進行大量擴增純化，并運用轉基因手段將修飾后的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，并分別形成轉基因細胞或轉基因動物：4）對步驟3）所得到的轉基因細胞或轉基因動物施加特定刺激，所述特定刺激能夠影響轉基因表達調控機制，使轉基因表達發生變化；5）從步驟4）所得到的刺激后的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白；6）分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列。
【技術特征摘要】
1.一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 1)通過查找基因組數據庫和相關載體庫，找到包含有目的基因或基因組位點的完整基因組序列，并根據以往對該基因或基因位點的相關研究，確定所需基因組片段長度，所述所需基因組片段長度的范圍在100kb-300kb之間； 2)對步驟I)所選定的基因組片段進行修飾，得到修飾后的基因組片段； 3)將步驟2)所得到的修飾后的基因組片段進行大量擴增純化，并運用轉基因手段將修飾后的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，并分別形成轉基因細胞或轉基因動物 4)對步驟3)所得到的轉基因細胞或轉基因動物施加特定刺激，所述特定刺激能夠影響轉基因表達調控機制，使轉基因表達發生變化； 5)從步驟4)所得到的刺激后的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白； 6)分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列。2.根據權利要求I所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特征在于所述步驟2)中的修飾的內容包括向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記以及向選定的基因組片段內的特定位點導入極稀少位點核酸酶的酶切位占. 所述向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記是將抗藥性基因和/或熒光蛋白等序列加入基因編碼區內，利用這些遺傳標記觀察轉入基因的表達情況，并進行定向篩選，獲得成功的轉基因細胞和/或動物； 所述向基因組片段內導入的極稀少核酸酶的酶切位點是一段能夠為極稀少核酸酶所特異性識別的核酸序列；所述極稀少核酸酶能夠識別并結合這些位點并與這些位點結合，并能夠在相應的酶切位點處切斷雙鏈DNA，制備出有雙鏈斷端的DNA ;所述極稀少核酸酶包括但不限于兆位核酸酶類、重組酶以及能夠在特定序列處切斷DNA的酶類；所述兆位核酸酶類包括內含子核酸內切酶以及歸巢子核酸內切酶；所述極稀少核酸酶識別的位點長度在IObp以上； 所述修飾的實現方式是基因組載體重組工程法和/或生物合成法。3.根據權利要求2所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特征在于所述步驟3)的具體實現方式是 3.I)通過載體在特定宿主菌內擴增或通過吉布森拼接大量合成修飾后的基因組片段； 3.2)通過常規的分子克隆方法對步驟3. I)所得到的大量的修飾后的基因組片段進行分離和純化； 3.3)運用轉基因方法將步驟3. 2)所得到的修飾后的基因組大片段導入目標細胞或目標動物內； 若導入目標細胞時，所述轉基因方法包括但不限于脂質體轉染或電穿孔轉染，利用選擇性培養基或標記基因篩選轉染陽性細胞，建立穩定的轉基因細胞； 若導入目標動物時，所述轉基因方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許漢鵬，
申請(專利權)人：許漢鵬，
類型：發明
國別省市：
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