本發明專利技術提供一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，首先采用低溫超高壓連續流細胞破碎機提取小球藻蛋白，再用堿性蛋白酶水解小球藻蛋白,超濾離心管過濾,獲得分子量大小范圍為0-3KD、3-5KD、5-10KD以及大于10KD的小球藻多肽。本發明專利技術得到的小球藻多肽具有下述抗腫瘤活性：對人肝癌細胞HepG2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為1mg/mL時，0-3KD和3-5KD多肽對肝癌細胞（HepG-2）體外生長抑制率分別達到19%和20%。因而本發明專利技術得到的小球藻抗腫瘤多肽有利于抗腫瘤保健食品和醫藥產品的開發利用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及小球藻深加工及生物
，具體涉及ー種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法。
技術介紹
小球藻(Chlorella pyenoidosa)是ー類普生性單細胞綠藻,屬于綠藻門、小球藻屬，生長速度快，易于培養，應用價值高.小球藻含有豐富的生物活性物質和藥用成分，作為ー種新型保健食品和藥物蘊藏著巨大潛力。小球藻具有抗腫瘤活性、増加免疫力、解毒保肝、降壓作用等，其粗蛋白含量高(50%左右)，品質好，已經成為小球藻應用領域十分活躍、備受重視的ー個方面. 生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽類。絕大多數蛋白質都是具有 一定功能作用的生物活性肽的前體物質，其肽鏈結構中存在著具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能區)，在正常狀態下，其功能區肽段隱藏在肽鏈中，但一旦單獨從蛋白質肽鏈中釋放出來，在適當的環境下，就能顯示出獨特的生物活性，這個功能肽段就是生物活性肽。現代生物代謝研究發現人類攝取的蛋白質經過消化道的多種酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的營養價值和生物效價。酶水解法獲得生物活性肽已經成為エ業化生產生物活性肽的主要手段。惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康和生命的疾病之一，目前已有的抗腫瘤藥物雖對大多數腫瘤有一定療效，但仍存在著治療效率低、選擇性差、毒副反應大、易產生瘤細胞耐藥等問題。因此，從不同途徑尋找高效、低毒、特異強的抗腫瘤藥物仍是藥物治療腫瘤的當務之急。近年來，人們越來越重視生物活性肽的研究和開發，各種生物活性肽不斷被發現和制備，多肽類藥物因其分子量小、無免疫原性、結構簡單、副作用小，其抗腫瘤活性的研究正在引起國內外學者的廣泛關注。
技術實現思路
為拓展小球藻在食品和生物醫學領域的應用，本專利技術的目的是提供ー種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法。 本方案目的通過以下方案來實現 ，具體包括如下步驟 (1)將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取； (2)將步驟(I)所述再提取后得到的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質粉； (3)在步驟(2)所得的小球藻蛋白質粉中，配置濃度為f4%(w/v，g/mL)的小球藻蛋白水溶液，加入堿性蛋白酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液；(4)步驟(3)所述上清液經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾，濾液再經過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。上述的，步驟(I)所述小球藻粉和純水的質量比為1:10 1:40，所述攪拌時間為30 120分鐘。上述的，步驟(I)所述提取小球藻蛋白質為在溫度4°C 10°C、壓カ50MPa 250MPa的條件下提取。上述的，步驟(I)所述再提取所提取的次數為I次 8次，姆次提取的時間為IOmin 60min。上述的，步驟(2)所述離心為在溫度Γ8 0C， 轉速為 5000^10000 r/min 下離心 10 60 min。上述的，步驟(3)所述水解的條件是溫度30^70 °C, pH= 5^12,水解時間為4 15h ;所述堿性蛋白酶與小球藻蛋白質水溶液的比為1% 5% (w/v, g/mL)。上述的，步驟(3)所述滅酶為在100で水中滅酶 10 min。上述的，步驟(3)所述離心為在8000 r/min下離心25 min。上述的，步驟(4)所述過濾為在8000 g、4で條件下經超濾離心管過濾。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點和技術效果 本專利技術得到的小球藻多肽具有下述抗腫瘤活性對人肝癌細胞H印G2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為I g/mL吋，0-3 KD和3-5 KD多肽對肝癌細胞(H印G-2)體外生長抑制率分別達到19%和20%。因而本專利技術得到的小球藻抗腫瘤多肽有利于抗腫瘤保健食品和醫藥產品的開發利用。具體實施例方式以下結合實例對本專利技術的具體實施作進ー步說明，但本專利技術的實施和保護范圍不限于此。實施例I 小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下 (I)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:20的質量比混合后攪拌50分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為6°C、壓カ為IOOMPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為3次，每次提取的時間為20min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉速為6000r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質粉。(2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，加入堿性蛋白酶進行水解，條件是溫度40°C，pH= 5，酶與底物的比為3%。水解5 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經過3 KD,5 KD的超濾離心管過濾(同樣在8000 g、4で條件下)。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。通過步驟(I廣(2)所得的小球藻多肽進行抗腫瘤活性檢測(使用MTT檢測方法)，結果表明，小球藻多肽對人肝癌細胞H印G2體外生長具有一定的抑制作用，當濃度為I g/mL時，0-3 KD和3-5 KD多肽對肝癌細胞(IfepG-2)體外生長抑制率分別達到19%和20%。實施例2 小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下 (1)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:30的質量比混合后攪拌80分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為8°C、壓カ為150MPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為6次，每次提取的時間為50min。最后，將獲得的溶液于溫度4 V，轉速為5000r/min下離心20 min,去除沉淀獲得蛋白上清液，再真空冷凍干燥,獲得小球藻蛋白質粉. (2)以步驟(I)得到的小球藻蛋白質粉為基礎，配置濃度為2%的小球藻蛋白溶液，カロ入堿性蛋白酶進行水解.實驗條件是溫度55 V，pH=9，酶與底物的比4%.水解9 h后，在100で水中滅酶10 min，室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4で條件下經截留分子量為10 KD的超濾離心管過濾。濾液再經過3 KD、5 KD的超濾離心管過濾。即可獲得分子量大小范圍為0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD,>10 KD的小球藻多肽水解液。檢測方法與結果同實施例I。實施例3 小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，步驟如下 (1)采用低溫超高壓連續流細胞破碎機對小球藻蛋白質進行提取將小球藻粉和純水以1:35的質量比混合后攪拌100分鐘得混合溶液。將上述混合溶液在溫度為9°C、壓カ為200MPa的條件下提取小球藻蛋白質，得到粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取，提取的次數為2次，每次提取的時間為lOmin。最本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種小球藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟：？（1）將小球藻粉和純水混合后攪拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白質，得到的粗提液作為下一次的待提取溶液進行再提取；（2）將步驟（1）所述再提取后得到的溶液離心，去除沉淀獲得蛋白上清液,？再真空冷凍干燥，獲得小球藻蛋白質粉；？（3）在步驟（2）所得的小球藻蛋白質粉中，配置濃度為1~4%（w/v）的小球藻蛋白水溶液，加入堿性蛋白酶進行水解，水解后，滅酶，冷卻至室溫后將水解液離心，取上清液；（4）？步驟（3）所述上清液經截留分子量為10？KD的超濾離心管過濾，濾液再經過3？KD、5？KD的超濾離心管過濾，即獲得分子量大小范圍為＜3？KD、3？5？KD、5？10？KD、>10？KD的小球藻多肽水解液。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張學武，王曉琴，
申請(專利權)人：華南理工大學，
類型：發明
國別省市：
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