本發(fā)明專利技術(shù)公開了一組用于小細(xì)胞肺癌檢測(cè)的微小核酸(miRNA)標(biāo)志物，具體來(lái)講，所述標(biāo)志物包括miR-375、miR-200a、miR-200b、miR-335和miR-95。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了檢測(cè)上述miRNA表達(dá)水平的引物及所述引物在制備小細(xì)胞肺癌檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和分子診斷領(lǐng)域，具體而言涉及根據(jù)個(gè)體的微小RNA(microRNA)的表達(dá)水平進(jìn)行小細(xì)胞肺癌的診斷。本專利技術(shù)還涉及具體的微小RNA的檢測(cè)方法及試劑。
技術(shù)介紹
microRNA研究是近年來(lái)腫瘤和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，microRNA的成熟狀態(tài)是一類長(zhǎng)約19-23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，在進(jìn)化上具有高度的保守性，可在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并參與哺乳動(dòng)物幾乎所有的病理和生理活動(dòng)，如個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自發(fā)現(xiàn)參與線蟲發(fā)育時(shí)序調(diào)控的I in-4與let-7以來(lái)，microRNA分別在2002年和2003年兩度入選Science雜志評(píng)出的年度十大科技突破。2005年的研究預(yù)測(cè)microRNA至少能調(diào)控5300 個(gè)人類基因，占所有蛋白編碼基因總數(shù)的30% ;隨著研究的深入和越來(lái)越多的miciORNA被發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)受到miCToRNA調(diào)控的蛋白編碼基因的比例還在不斷上升。近年來(lái)，miCToRNA與腫瘤發(fā)生之間的相關(guān)性逐漸成為研究的重點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miCToRNA通過(guò)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)參與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等疾病的發(fā)生。有學(xué)者甚至提出了“癌microRNAs” (OncomiRs)的觀點(diǎn)，認(rèn)為microRNAs的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了類似癌基因的角色。最新研究表明腫瘤組織普遍具有特征性的miRNA表達(dá)譜，能夠作為癌癥的標(biāo)志物。肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率居癌癥死亡率之首。肺癌主要類型可以分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌。小細(xì)胞肺癌在肺癌發(fā)病率中大約占15% 20%左右，其在臨床上表現(xiàn)為腫瘤侵染性強(qiáng)，在診斷時(shí)常已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，該型腫瘤對(duì)放療和化療都十分敏感，近期療效較好，但是長(zhǎng)期生存率很低，高達(dá)95%以上的小細(xì)胞肺癌患者最終將因腫瘤轉(zhuǎn)移或疾病復(fù)發(fā)而死亡。腫瘤標(biāo)記物是反映腫瘤存在的一類物質(zhì)，它的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，從而幫助腫瘤的診斷、分類以及預(yù)后判斷等，腫瘤標(biāo)記物應(yīng)該具有良好的敏感度和特異性。目前對(duì)小細(xì)胞肺癌較為敏感度腫瘤標(biāo)志物腫瘤較少，常用的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)是較好的小細(xì)胞肺癌標(biāo)志物,但其存在早期病人陽(yáng)性率低，非小細(xì)胞肺癌也有陽(yáng)性結(jié)果，健康人與小細(xì)胞肺癌患者差異不大等不足。目前針對(duì)小細(xì)胞肺癌較為敏感的腫瘤標(biāo)志物種類很少，因此本領(lǐng)域迫切需要一種具有良好的敏感性與特異性的診斷標(biāo)志物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是根據(jù)組織樣本，尤其是血清/血漿中microRNA的表達(dá)水平進(jìn)行小細(xì)胞肺癌的早期診斷。本專利技術(shù)要解決的另一個(gè)問(wèn)題是提供用于小細(xì)胞肺癌診斷的方法及相應(yīng)診斷試劑。為解決上述問(wèn)題，本專利技術(shù)一方面提供了一種小細(xì)胞肺癌的診斷方法，所述方法包括以下步驟a)測(cè)定人類來(lái)源的被檢測(cè)樣本和參考樣本中miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335或miR-95的表達(dá)水平；b)比較被檢測(cè)樣本中miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335 或 miR-95 的表達(dá)水平與參考樣本中 miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335 或miR-95的表達(dá)水平；其中，被檢測(cè)樣本中上述miRNA的任一種的表達(dá)水平與參考樣本中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平相比出現(xiàn)顯著變化，表明該個(gè)體可能患有小細(xì)胞肺癌。具體來(lái)講，被檢測(cè)樣本中miRNA的表達(dá)水平比參考樣本中miRNA的表達(dá)水平升高時(shí)，被檢測(cè)樣本提供者可能患有小細(xì)胞肺癌。在較佳的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的樣本為組織樣本如患者的肺部活檢樣本及提取自患者的總RNA或小RNA組分。在另一較佳的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的樣本也可選自血漿、血清、提取自血清或血漿的總RNA或小RNA組分。在更佳的實(shí)施方案中，直接以血清或血漿作為檢測(cè)樣本。“被檢測(cè)樣本中miRNA的表達(dá)水平與參考樣本中miRNA的表達(dá)水平相比出現(xiàn)顯著變化”是指，相對(duì)于參考樣本中miR-375、miR-200a、miR-200b、miR-335或miR-95的表達(dá)水平來(lái)說(shuō)，被檢測(cè)樣本中miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335或miR-95的表達(dá)水平出現(xiàn) 顯著增加。“增加”在此指的是miRNA水平增加至少10%，包括例如增加至少15%、20%、30%、40%、50% 或更多。本專利技術(shù)中，參考樣本來(lái)自健康人源肺部活檢樣本及提取自患者的總RNA或小RNA組分或者患有除小細(xì)胞肺癌之外其他癌癥患者的樣本。本專利技術(shù)另一方面提供了上述microRNA的檢測(cè)方法，所述方法選自擴(kuò)增法、雜交法或測(cè)序法。具體地說(shuō)，擴(kuò)增法包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR);雜交法包括芯片雜交和Northern雜交。更具體地，在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，使用的引物組合為表I中所列的miR-375、miR-200a、miR-200b、miR-335或miR-95檢測(cè)的逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物組合。在本專利技術(shù)的另一方面，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)也可以使用商業(yè)上可購(gòu)買的試劑來(lái)進(jìn)行，只要該試劑能夠檢測(cè)被檢測(cè)樣本中miR-375、miR-200a、miR-200b、miR-335或miR-95的表達(dá)水平即可。對(duì)于雜交檢測(cè)法，樣本中miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335 或 miR-95 的表達(dá)水平通過(guò)芯片上或膠片上上述miRNA的雜交信號(hào)得到確定；具體地是根據(jù)芯片上或膠片上被測(cè)定樣本中上述miRNA的雜交信號(hào)與參考樣本對(duì)應(yīng)的miRNA的雜交信號(hào)之間的比率確定。另一方面，本專利技術(shù)提供能檢測(cè)miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335 和 / 或miR-95的存在或表達(dá)水平的試劑在制備診斷小細(xì)胞肺癌用的產(chǎn)品中的用途。在一具體實(shí)施例中，所述試劑包括miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335和miR-95的特異性探針或引物。在一具體實(shí)施例中，所述產(chǎn)品為檢測(cè)試劑盒或生物芯片。在一具體實(shí)施例中，所述弓I物包括所述miR-375、miR-200a、miR_200b、miR-335和miR-95的逆轉(zhuǎn)錄引物、上游引物和下游引物。在一具體實(shí)施例中，所述引物選自下文所述的引物序列或下文所述的序列組合。本專利技術(shù)提供一種小細(xì)胞肺癌檢測(cè)系統(tǒng)，包含miR-375、miR_200a、miR_200b、miR-335和/或miR-95的引物。在一實(shí)施例中，本專利技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)包含選自以下的引物(I)SEQ ID NO : I或其長(zhǎng)40個(gè)以上堿基的片段，或在SEQ ID NO : I或所述片段中具有1-5個(gè)堿基插入、缺失或突變，但仍保持SEQ ID NO 1的結(jié)合特異性的序列，或與上述序列具有50%及以上同源性的寡聚核苷酸序列；(2) SEQ ID NO 2或其長(zhǎng)14個(gè)堿基以上的片段，或在SEQ ID NO 2或所述片段中具有1-3個(gè)堿基插入、缺失或突變，但仍保持SEQ ID NO 2的結(jié)合特異性的序列，或與上述序列具有50%及以上同源性的寡聚核苷酸序列；(3) SEQ ID NO 3或其長(zhǎng)40個(gè)以上堿基的片段，或在SEQ ID NO 3或所述片段中具有1-5個(gè)堿基插本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
能檢測(cè)miR？375、miR？200a、miR？200b、miR？335和/或miR？95的存在或表達(dá)水平的試劑在制備診斷小細(xì)胞肺癌用的產(chǎn)品中的用途。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱學(xué)良，鄢秀敏，趙惠杰，朱蕾，季紅斌，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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