本發明專利技術提供一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法及試劑盒，所述方法包括以下步驟：單頭家蠅基因組DNA的提取；家蠅CYP6D1v1抗性等位基因的分子檢測；所述試劑盒包括：單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6D1v1抗性等位基因分子檢測的試劑。本發明專利技術的方法需要生物材料少；對材料的要求低；可以區分種群的雜/純合狀態：有利預測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；快速、準確。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及家蠅對擬除蟲菊酯類代謝抗性的分子檢測方法，適合用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑由CYP6D1V1介導的代謝抗性的快速檢測，屬于生物
技術介紹
家蠅(Musca domestica)是一種重要的疾病傳媒,據報道它可以傳播100多種人畜疾病。家蠅也是重要的畜牧業害蟲，家蠅的發生可以導致畜禽產品產量和質量的降低。因此家蠅種群的控制對于人類的健康和國民經濟的發展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長期以來主要依賴化學農藥，抗藥性問題突出。抗藥性導致殺蟲劑殺蟲效率的下降，由此引發諸如殺蟲劑使用次數和劑量增加，蟲媒人畜疾病的流行等問題已給人類帶來巨大損失。擬除蟲菊酯殺蟲劑(如溴氰菊酯)已廣泛用于家蠅的防治，家蠅對這類殺蟲劑普 遍產生了抗性。抗藥性的檢測是科學制定有效的防治措施的前提，對減少化學藥劑對環境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導意義。家蠅對擬除蟲菊酯類的抗性的檢測常采用生物測定，這種方法存在如下缺點(I)試驗周期長一般需要24小時以上才能得到結果；(2)對試蟲的數量和質量要求高為保證生測結果的準確性，需要使用特定生理狀態的試蟲；(3)難于檢測早期抗性和預測抗性的發展趨勢生物測定的方法只能記錄殺蟲劑劑量和試蟲死亡率的信息,而無法測定個體的基因型。近年來，隨著對家蠅抗藥性抗性分子機制的了解，國內外開始嘗試家蠅抗性的分子檢測技術的研究。研究表明，細胞色素P450介導的代謝解毒作用增強是家蠅對擬除蟲菊酯類抗性的主要機制。在高抗性的家蠅品系如美國的LPR品系和中國的BJD品系，抗性都與家蠅的CYP6Dlvl等位基因相關聯，CYP6Dlvl抗性等位基因的序列特點是其5’啟動子區存在一段15bp的插入片段。進一步的研究結果表明CYP6Dlvl這一等位基因在美國和中國的自然家蠅種群中也普遍存在。
技術實現思路
因此，本專利技術的目的是針對目前家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性檢測方法的周期長、對試蟲的數量和質量要求高，難于檢測早期抗性和預測抗性的發展趨勢的不足，提供一種高效、快速、對材料要求低、需要生物材料少的家蠅由細胞色素P450 CYP6Dlvl介導的對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性的分子檢測方法，從而能夠有效殺蠅，減少傳染疾病的傳播。針對上述目的，本專利技術的技術方案如下—方面，本專利技術提供一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法，該方法包括以下步驟步驟I :單頭豕妮基因組DNA的提取；步驟2 :家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測。優選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。 優選地，所述步驟2中通過PCR擴增進行CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測。優選地，所述PCR擴增中所用的特異引物為qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。另一方面，本專利技術提供一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測的試劑盒，所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測的試劑。優選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。優選地，用于對家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測的試劑包括以下特異引物 qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。再一方面，本專利技術提供一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性檢測的試劑盒在家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測中的應用。本專利技術相比現有技術有如下優點本專利技術建立的抗性分子檢測技術與傳統生物測定相比具有如下優點⑴需要生物材料少，數量在50-200頭就可以滿足檢測要求；(2)對材料的要求低可以采用任何蟲態的試蟲，可以用活體，也可以用保存的樣品，可以用整頭家蠅，也可以用蟲體的某一部位(如雙翅)；(3)可以區分種群的雜/純合狀態有利預測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；(4)快速從DNA的提取到PCR產物的檢測，數小時就可以完成。本專利技術提供了的方法準確性高運用限制性內切酶對DNA序列設計的特異性，結果的準確性高。附圖說明以下，結合附圖來詳細說明本專利技術的實施方案，其中圖I為單頭家蠅PCR擴增的試驗結果示意圖，圖中1-6為PCR擴增的樣品，M為DNA分子量標記(DNA Marker)；圖2為單頭家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結果示意圖，圖中SS為敏感純合子；SR為雜合子；RR為抗性純合子⑷為IOObp DNA分子量標記(DNA Marker)；圖3為北京自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結果示意圖，圖中1-10為樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNA Marker)；圖4為吉林長春自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結果示意圖，圖中1-10為檢測樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNAMarker)；圖5為山東濟南自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結果示意圖，圖中1-15為檢測樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNAMarker)。具體實施例方式實施例I 單頭家蠅基因組DNA的提取(參考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United States. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本專利技術所用家蠅分別為實驗室保存的擬除蟲菊酯類殺蟲劑敏感純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)，前述家蠅品系為BJD系，均可得自中國科學院動物研究所(北京市朝陽區北辰西路I號院-5號)，以及分別采自山東、北京與吉林的野生家蠅，也可得自中國科學院動物研究所。I.單頭家蠅基因組DNA的提取方法(參考Rinkevich et al 2006)(I)取單頭家蠅(去腹部)置于1.5mL體積的離心管(印pendorf管)中，加入0.5mL裂解緩沖液，碾磨將蟲體搗碎，置60度溫浴，20分鐘后取出；(2)加75 μ L的8Μ醋酸鉀，混勻，置冰上10分鐘； (3) 14000g離心5min，取400 μ L上清液(避免取到沉淀)轉至新的離心管；(4)加入800 μ L (上清液的2倍體積)100%冰冷乙醇，室溫放置IOmin ；(5)離心10分鐘，棄上清，沉淀用0. 5mL70%乙醇清洗；(6)離心5分鐘,沉淀干燥后,加入50 μ L水重溶。制備的DNA樣品可直接用于后續的PCR，也可以將樣品保存在4°C下備用，或在-20°C條件下長期保存。以上方法中使用的試劑配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高壓滅菌，室溫保存)；(2) 0. 15M 精胺(spermine)(過濾滅菌，分裝保存在 _20本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法，該方法包括以下步驟：步驟1：單頭家蠅基因組DNA的提取；步驟2：家蠅CYP6D1v1抗性等位基因的分子檢測。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：邱星輝，李梅，邸妙詞，潘婧，周云輝，
申請(專利權)人：中國科學院動物研究所，
類型：發明
國別省市：
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