檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，提供了一種檢測核酸突變的固相載體、試劑盒和方法。所述檢測核酸突變的固相載體表面固定有MutS；所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。本發明專利技術還提供了包括上述檢測核酸突變的固相載體的試劑盒，以及基于上述檢測核酸突變的固相載體進行核酸突變檢測的方法。本發明專利技術的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒在實際應用中能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率。本發明專利技術的檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，更具體地說，涉及。
技術介紹
錯配識別蛋白(mismatch binding protein,MutS)是錯配修復系統行使修復功能的第一個蛋白，能夠識別并結合全部八種堿基錯配 ，還能識別結合I至4個核苷酸插入或缺失形成的loop環結構引起的錯配。 利用MutS的上述特殊功能，近年來己有一些研究探索MutS在檢測和富集突變以及檢測SNP方面的應用。其中，Rober Wanger等提出了一種利用固定化的MutS檢測突變的方法，大致包括以下步驟1)將含有MutS溶于反應緩沖液中，所述反應緩沖液為pH7. 6，含有5mM氯化鎂，O. ImM 二硫蘇糖醇，O. OlmMEDTA的Tris-HCl溶液；2)將預濕的硝酸纖維膜置于48孔板中，加入含有MutS的反應緩沖液，每孔含有的MutS 500ng，室溫反應20min ；3)然后加入3% BSA, 200 μ L/孔，封閉lh，洗去封閉液；4)將待測DNA溶于含有3% BSA的反應緩沖液中，并加至經步驟3)處理后的48孔板中，O. 05 μ g/ μ L-0. 5 μ g/ μ L，20 μ L，室溫反應30min ;5)用100 μ L反應緩沖液沖洗5次；6)加入含O. 05 μ g/mL的鏈霉親和素_辣根過氧化物酶(Str印tavidin-HRP)，含BSA的反應緩沖液，100 μ L/孔，室溫反應20min ；7)用100 μ L反應緩沖液沖洗5次；8)將硝酸纖維膜從48孔板中移出，用反應緩沖液沖洗,吸干，然后浸入化學發光試劑(ECL development solution, Amersham)中反應lmin,吸干后用X射線拍圖。上述基于MutS檢測突變的方法中檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且無法直接排除檢測結果中的假陰性結果，準確率不高。如果要排除檢測結果中的假陰性實驗結果，需要對同一樣品進行重復檢測，這就必然進一步降低檢測效率，需要更多的待測樣品，而且這種重復檢測也僅僅能排除假陰性中因檢測步驟中的失誤引起的假陰性結果，而對于實驗材料，如固定有MutS的固相載體上固定的MutS單位密度過低而引起的假陰性結果無能為力。上述方法中披露了一種固定有MutS的固相載體，在具體的檢測應用中，該固定有MutS的固相載體檢測步驟繁瑣，檢測效率不高，且至少需要兩個固定有MutS的固相載體才能排除檢測結果中的部分假陰性結果?；谏鲜龇椒ㄅ兜墓潭ㄓ蠱utS的固相載體形成的試劑盒同樣存在上述問題。因此需要一種新的，該固相載體、試劑盒在實際應用中能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率；該檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種新的，旨在解決現有技術檢測步驟繁瑣、檢測效率不高、檢測結果準確率低的問題。一種檢測核酸突變的固相載體，所述固相載體表面固定有MutS ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。其中，所述報告基團可為熒光標記基團或無熒光標記基團。其中，所述無熒光標記基團優選為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。上述任一種方案中，所述固相載體表面為適于包被蛋白的材料。優選的，所述材料包括天然纖維素、被修飾的纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龍、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、橡膠、金屬、金屬氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一種。 一種檢測核酸突變的試劑盒，包括檢測核酸突變的固相載體；所述固相載體表面固定有MutS ;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。其中，所述固相載體可采用本專利技術的檢測核酸突變的固相載體中的任一種。其中，所述試劑盒還可包括標準品；所述標準品包括陽性標準品和陰性標準品；所述陽性標準品為含有堿基錯配或由I至4個核苷酸缺失或插入引起的錯配的雙鏈核苷酸分子；所述陰性標準品為完全互補的雙鏈核苷酸分子。其中，所述試劑盒還可包括用于擴增特定區域的特異性引物。上述任一種方案中，所述報告基團為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素；所述試劑盒還包括顯色試劑；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應進而指示固相載體上MutS的數量。一種基于本專利技術的檢測核酸突變的固相載體檢測核酸突變的方法，所述MutS所含有的報告基團為熒光標記基團或無熒光標記基團；所述熒光標記基團的熒光標記與待測樣品攜帶的熒光標記不同；所述包括以下步驟 A.將帶有熒光標記的待測樣品和陰性對照品混合，變性，退火，得帶熒光標記的退火產物；所述陰性對照品為完全互補的雙鏈核酸分子，該核酸分子含有與待測樣品的待檢測區域的野生型序列完全相同的核酸序列； B.將帶熒光標記的退火產物加至檢測核酸突變的固相載體上，使帶熒光標記的退火產物中的存在錯配的退火產物與固相載體上的MutS結合，洗滌除去未結合至固相載體上的退火產物； C.檢測與固相載體結合的退火產物的熒光標記和固相載體上的MutS的報告基團，以確定待測樣品中是否存在突變。其中，所述步驟C可包括 Cl.熒光掃描步驟B的產物，初步確定待測樣品中是否含有突變； C2.對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數量； C3.根據步驟Cl和C2的結果確定待測樣品中是否存在突變。其中，步驟A之前可包括步驟A0.利用帶熒光標記的特異性引物對源核酸進行擴增，得帶熒光標記的待測樣品；或利用帶熒光標記的核苷酸對源核酸進行末端標記，得帶熒光標記的待測樣品。上述任一種方案中，所述報告基團可為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、親和素或鏈霉親和素。上述任一種方案中，所述固相載體表面的材料包括硝酸纖維素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龍中的至少一種。其中，所述步驟C可包括 Cl.熒光掃描步驟B的產物，初步確定待測樣品中是否含有突變； C2.利用顯色試劑對MutS上的報告基團進行檢測，以確定固相載體上MutS的數量；所述顯色試劑，用于與所述報告基團反應并指示固相載體上MutS的數量； C3.根據步驟Cl和C2的結果確定待測樣品中是否存在突變。由上可知，本專利技術的檢測核酸突變的固相載體、試劑盒,通過對固相載體上固定的MutS的特殊設計，在應用于檢測核酸突變的過程中，能夠減少檢測步驟，提高檢測效率， 排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率；本專利技術的檢測核酸突變的方法能夠減少檢測步驟，提高檢測效率，排除檢測結果中的假陰性結果，提高檢測結果的準確率。附圖說明圖I是本專利技術一個實施例中克隆菌菌落PCR鑒定圖。圖2是本專利技術一個實施例中表達菌菌落PCR鑒定圖。圖3是本專利技術一個實施例中所得融合蛋白His-TthMutS PAGE電泳圖。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。本專利技術提供了一種檢測核酸突變的固相載體，所述固相載體表面固定有MutS;所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。需要說明的是所述報告基團指示固相載體上MutS的數量的方式可以是直接指示也可以間接指示；所述直本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測核酸突變的固相載體，其特征在于，所述固相載體表面固定有MutS；所述MutS含有報告基團；所述報告基團用于指示固相載體上MutS的數量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：盛司潼，
申請(專利權)人：深圳市華因康高通量生物技術研究院，
類型：發明
國別省市：