特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒及檢測方法技術

本發(fā)明專利技術特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒及檢測方法涉及一種用環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術快速檢測肉品中是否含有某種被測定肉的技術。試劑盒中包括五組相互獨立的A型反應液，即反應液A-1、A-2、A-3、A-4、A-5，還包括能與該五組相互獨立A型反應液分別反應的反應液B；以及用該試劑盒分別檢測牦牛肉、雞肉、豬肉、兔肉、羊肉的方法。優(yōu)點：本試劑盒根據(jù)牦牛、雞、豬、兔、羊五種肉類的基因分別設計了特異性的兩種內(nèi)引物、兩種外引物和兩種環(huán)引物。使用本發(fā)明專利技術可快速的對某種肉類或其多種肉混合物制品進行某種肉有無的檢測，由于檢測速度快，適合作為肉制品摻假的治法工具在基層推廣。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于食品生物
，涉及一種用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術快速檢測肉品中是否含有某種被測定肉的試劑盒，并涉及一種使用該種試劑盒快速檢測是否含有被測定肉的方法。
技術介紹
肉制品市場上出現(xiàn)很多低價值的普通肉類摻雜或是替代營養(yǎng)價值和價格都較高的肉類行為，以次充好，對消費者財務和健康都會有損害。尤其是若摻入豬肉，對于回族消費者的宗教信仰都會有影響。因此有必要尋找一種簡單快速的方法鑒定肉制品是否有指定的肉和是否有指定不應該有的肉，為鑒定是否有摻假行為提供科學依據(jù)。肉種類鑒別方法可以分為形態(tài)學、理化學、免疫學和分子生物學。市場上很多的熟 肉制品經(jīng)過粉碎、添加香料和烘烤等處理后，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學和理化學的方法很難進行準確的肉類品種鑒定。由于肉制品在加工過程中易導致蛋白質(zhì)變性，使得應用抗體特異性的ELISA法鑒定肉類品種的可靠性和穩(wěn)定性較差。目前對于肉類品種的鑒定采用基于核酸特異性的PCR法較為廣泛，但是基于PCR技術需要精密的擴增儀器，而且產(chǎn)物的鑒定是通過凝膠電泳來觀察，不適于在現(xiàn)場快速檢測，在基層推廣難度較高。目前采用LAMP法鑒定肉類僅在生鮮肉基礎上，對于經(jīng)過加工處理后的肉制品用LAMP檢測法測定是否含有某種待測定肉類品種未見報道。公開號為CN101591713B的中國專利《一種小鵝瘟病毒LAMP檢測試劑盒》公開號為和CN101225447B的中國專利《一種新城瘟病毒LAMP檢測試劑盒》分別公開了用LAMP方法檢測病毒的方法，沒有對肉類的檢測。中國專利申請201010226683. 4《一種鑒別羊肉和鴨肉的PCR-RELP方法》，中國專利申請2007101755520.6《雞肉、牛肉、豬肉和馬肉多重PCR快速檢測試劑盒及其應用》，都是基于PCR技術，需要精密的擴增儀器，而且產(chǎn)物的鑒定是通過凝膠電泳來觀察，不適于在現(xiàn)場快速檢測，在基層推廣難度較高。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的就在于克服上述檢測技術的缺陷，提供一種用LAMP法快速檢測指定肉類品種的試劑盒，及其采用熒光染料法，能用肉眼觀察顯色的快速檢測方法，可用于檢測肉制品是否有摻假行為；還提供LAMP法檢測牦牛肉、雞肉、豬肉、兔肉、羊肉的引物。本專利技術的試劑盒技術方案是 特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒，包括五組相互獨立的A型反應液，該五組相互獨立的A型反應液是檢測牦牛肉的反應液A-I、檢測雞肉的反應液A-2、檢測豬肉的反應液A-3、檢測兔肉的反應液A-4或檢測羊肉的反應液A-5,還包括能與該五組相互獨立A型反應液分別反應的反應液B ;各反應液的成分和配合比如下 (I)檢測牦牛肉的反應液A-I :每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> I.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M牦牛肉的內(nèi)引物I : GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATTTTTTTAAAGACTAGACCTACAAGTCA, 1.000 μ I的20 μ M牦牛肉的內(nèi)引物2 : TAGGGATAACAGCGCAATCCTTTTTATGTCCTGATCCAACATCG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 I :AAAAAATCCTCCGAACGATT、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 2 :GATAGCGGTTGCACCATC、 O. 500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的環(huán)引物 I :GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、 0.500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的環(huán)引物 2 :TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (2)檢測雞肉的反應液A-2:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> 1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M雞肉的內(nèi)引物I : TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGATTTTTCCCACTATGCCTAGCCCTA、 1.000 μ I的20 μ M雞肉的內(nèi)引物2 :AACTCTAAGGACTTGGCGGTGCTTTTGGTGGTTGGGTGAATCGTG, O. 125 μ I 的 20 μ M 雞肉的外引物 I :AAAGCTAGGACCCAAACTGG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 雞肉的外引物 2 :GGTATGTAGGCTGTGCTGG、 O. 500 μ I 的 20 μ M 雞肉的環(huán)引物 I :TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、 0.500 μ I 的 20 μ M 雞肉的環(huán)引物 2 :CCCAAACCCACCTAGAGGAG、4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (3)檢測豬肉的反應液A-3:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> 1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I.000 μ I的20 μ M豬肉的內(nèi)引物I : CAGGCTCCTCTAGGTGGATGTTTTTCGCAACTGCCTAAAACTC、1.OOO μ I的20 μ M豬肉的內(nèi)引物2 : TCGATAAACCCCGATAGACCTTTTTTTAGGGTTTGCTGAAGATGG, O. 125 μ I 的 20 μ M 豬肉的外引物 I :CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、 O. 125 μ I 的 20 μ M 豬肉的外引物 2 ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT, O. 500 μ I 的 20 μ M 豬肉的環(huán)引物 I :AGCACCGCCAAGTCCTTT、 0.500 μ I 的 20 μ M 豬肉的環(huán)引物 2 CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT,4. 000 μ I 的 25mM MgCl2、 4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水；· 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ；本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒，包括五組相互獨立的A型反應液，該五組相互獨立的A型反應液是檢測牦牛肉的反應液A？1、檢測雞肉的反應液A？2、檢測豬肉的反應液A？3、檢測兔肉的反應液A？4或檢測羊肉的反應液A？5，還包括能與該五組相互獨立A型反應液分別反應的反應液B；各反應液的成分和配合比如下：（1）檢測牦牛肉的反應液A？1：每管23.000？μl的組成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM牦牛肉的內(nèi)引物1：GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT？TTTT？TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、1.000？μl的20μM牦牛肉的內(nèi)引物2：TAGGGATAACAGCGCAATCCT？TTTT？ATGTCCTGATCCAACATCG、0.125？μl的20μM牦牛肉的外引物1：AAAAAATCCTCCGAACGATT、0.125？μl的20μM牦牛肉的內(nèi)引物2：GATAGCGGTTGCACCATC、0.500？μl的20μM牦牛肉的環(huán)引物1：GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、0.500？μl的20μM牦牛肉的環(huán)引物2：TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜堿、余量為滅菌蒸餾水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/？pH？8.8、？100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X？100；（2）檢測雞肉的反應液A？2：每管23.000？μl的組成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM雞肉的內(nèi)引物1：TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT？TTTT？CCCACTATGCCTAGCCCTA、1.000？μl的20μM雞肉的內(nèi)引物2：AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC？TTTT？GGTGGTTGGGTGAATCGTG、0.125？μl的20μM雞肉的外引物1：AAAGCTAGGACCCAAACTGG、0.125？μl的20μM雞肉的內(nèi)引物2：GGTATGTAGGCTGTGCTGG、0.500？μl的20μM雞肉的環(huán)引物1：TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、0.500？μl的20μM雞肉的環(huán)引物2：CCCAAACCCACCTAGAGGAG、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜堿、余量為滅菌蒸餾水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/？pH？8.8、？100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X？100；（3）檢測豬肉的反應液A？3：每管23.000？μl的組成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.500？μl？的10mM？dNTP、？1.000？μl的20μM豬肉的內(nèi)引物1：CAGGCTCCTCTAGGTGGATG？TTTT？TCGCAACTGCCTAAAACTC、1.000？μl的20μM豬肉的內(nèi)引物2：TCGATAAACCCCGATAGACCTT？TTTT？TAGGGTTTGCTGAAGATGG、0.125？μl的20μM豬肉的外引物1：CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、0.125？μl的20μM豬肉的內(nèi)引物2：ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT、0.500？μl的20μM豬肉的環(huán)引物1：AGCACCGCCAAGTCCTTT、0.500？μl的20μM豬肉的環(huán)引物2：CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT、4.000？μl？的25mM？MgCl2？、4.000？μl？的5M甜菜堿、余量為滅菌蒸餾水；其中，10×Lamp？buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/？pH？8.8、？100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X？100；（4）檢測兔肉的反應液A？4：每管23.000？μl的組成及配合比如下，2.500？μl？的10×Lamp？buffer、1.000？μl？的Bst？？DNA聚合酶8U/μl、3.50...

【技術特征摘要】
1.特定肉制品的LAMP法檢測試劑盒，包括五組相互獨立的A型反應液，該五組相互獨立的A型反應液是檢測牦牛肉的反應液A-1、檢測雞肉的反應液A-2、檢測豬肉的反應液A-3、檢測兔肉的反應液A-4或檢測羊肉的反應液A-5,還包括能與該五組相互獨立A型反應液分別反應的反應液B ;各反應液的成分和配合比如下 (1)檢測牦牛肉的反應液A-I:每管23. OOO μ I的組成及配合比如下，.2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> I. 000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、.3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 I. 000 μ I的20 μ M牦牛肉的內(nèi)引物I : GGTAACTTGTTCCGTTGATCAAATT-TTTT-TAAAGACTAGACCTACAAGTCA、 .1.000 μ I的20 μ M牦牛肉的內(nèi)引物2 : TAGGGATAACAGCGCAATCCT-TTTT-ATGTCCTGATCCAACATCG、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的外引物 I :AAAAAATCCTCCGAACGATT、 O. 125 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的內(nèi)引物 2 :GATAGCGGTTGCACCATC、 O. 500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的環(huán)引物 I :GGATCAATGAGCGATAGAGTGATT、 .0.500 μ I 的 20 μ M 牦牛肉的環(huán)引物 2 TAAGAGTCCATATCGACAATAGGGT,.4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 .4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (2)檢測雞肉的反應液A-2:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，.2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> .1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、.3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 .1.000 μ I的20 μ M雞肉的內(nèi)引物I : TGCTCGTAGTTCTCAGGCGGAT-TTTT-CCCACTATGCCTAGCCCTA、 .1.000 μ I的20 μ M雞肉的內(nèi)引物2 : AACTCTAAGGACTTGGCGGTGC-TTTT-GGTGGTTGGGTGAATCGTG,O. 125 μ I 的 20 μ M 雞肉的外引物 I :AAAGCTAGGACCCAAACTGG、O.125 μ I 的 20 μ M 雞肉的內(nèi)引物 2 GGTATGTAGGCTGTGCTGG,O.500 μ I 的 20 μ M 雞肉的環(huán)引物 I :TGTGTGATGGGAGGTATCTAGATT、O.500 μ I 的 20 μ M 雞肉的環(huán)引物 2 CCCAAACCCACCTAGAGGAG,.4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 .4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (3)檢測豬肉的反應液A-3:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·I.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I. 000 μ I的20 μ M豬肉的內(nèi)引物I : CAGGCTCCTCTAGGTGGATG-TTTT-TCGCAACTGCCTAAAACTC, ·1.000 μ I的20 μ M豬肉的內(nèi)引物2 : TCGATAAACCCCGATAGACCTT-TTTT-TAGGGTTTGCTGAAGATGG, ·O. 125 μ I 的 20 μ M 豬肉的外引物 I :CAAAACTATTCGCCAGAGTAC、 ·O. 125 μ I 的 20 μ M 豬肉的內(nèi)引物 2 ATTGTGCTTACTATTGTTCCTT, ·O. 500 μ I 的 20 μ M 豬肉的環(huán)引物 I :AGCACCGCCAAGTCCTTT、 ·0.500 μ I 的 20 μ M 豬肉的環(huán)引物 2 CCAACCCTTGCCAATTCAGCCTAT,·4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 ·4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (4)檢測兔肉的反應液A-4:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I.000 μ I的20 μ M兔肉的內(nèi)引物I : GGAAGGCTATGTCAGGAGCC-TTTT-TATAATTGGAGGCTTCGGGA、 ·1.000 μ I的20 μ M兔肉的內(nèi)引物2 : CATTCCTTCTTCTACTAGCCTCCT-TTTT-GGTGGATAAACAGTTCAGC、 ·O. 125 μ I 的 20 μ M 兔肉的外引物 I :ACATGCCTTTGTAATAATCTTCT、 ·O.125 μ I 的 20 μ M 兔肉的內(nèi)引物 2 :GCATGTGCAAGATTACCG、 ·O.500 μ I 的 20 μ M 兔肉的環(huán)引物 I :TGACCGAACAGGGGGACT、 ·0.500 μ I 的 20 μ M 兔肉的環(huán)引物 2 :AGTAGAAGCTGGGGCGGGGA、·4.000 μ I 的 25mM MgCl2、 ·4. 000 μ I的5Μ甜菜堿、 余量為滅菌蒸餾水； 其中，IOXLamp buffer含有200mM三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽/ pH 8.8, IOOmM氯化鉀、IOOmM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1%曲拉通X-100 ； (5)檢測羊肉的反應液A-5:每管23. 000 μ I的組成及配合比如下，·2.500 μ I 的 IOXLamp buffer> ·1.000 μ I 的 Bst DNA 聚合酶 8U/μ I、·3.500 μ I 的 IOmM dNTP、 ·I.000 μ I的20 μ M羊肉的內(nèi)引物I :ATGTGGTTATAGCCCCTAGACATAA-TTTT-CCGGTTTTATCCACTAACAGAA、. 1.OOO μ I的20 μ M羊肉的內(nèi)引物2 : TATGCGCCCTCACCCAAAAT-TTTT-TTACTATTATGAGGCCGAGTT、O.125 μ I 的 20 μ M 羊肉的外引物 I :AGCAGGCATCTTCCTACT、O.125 μ I 的 20 μ M 羊肉的內(nèi)引物 2 GGGGTTGATTAATTCCGATTG,O.500 μ I 的 20 μ M 羊肉的環(huán)引物 I :GTTATTTAAACCGGTTA...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：唐善虎，李雪，郝小倩，
申請(專利權)人：西南民族大學，唐善虎，
類型：發(fā)明
國別省市：