降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內(nèi)生細(xì)菌的獲得方法和在防治植物黃萎病上的應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種具有防治植物黃萎病功能的內(nèi)生菌的獲得方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內(nèi)生細(xì)菌的獲得方法，是把從植物體內(nèi)分離得到的植物內(nèi)生細(xì)菌的菌體與大麗輪枝菌毒素混合培養(yǎng)，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定混合培養(yǎng)后的蛋白條帶與原毒素的蛋白條帶進(jìn)行比較，混合培養(yǎng)體系缺少了26KD蛋白條帶的為目的菌株。該方法目標(biāo)明確，機理清楚。解決了生物防治土傳病害中的生防微生物受土壤環(huán)境影響大，效果不穩(wěn)定的缺點。本發(fā)明專利技術(shù)利用大麗輪枝菌的致病特點和植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)傳導(dǎo)的特性，直接針對引起植物病害的黃萎病菌毒素篩選降解毒素的內(nèi)生細(xì)菌以達(dá)到有效防治植物黃萎病的目的。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，特別涉及植物內(nèi)生細(xì)菌通過降解大麗輪枝菌毒素的方法來有效防治植物黃萎病的危害。
技術(shù)介紹
大麗輪枝菌可引起植物黃萎病，該病是一種危害性極大的維管束系統(tǒng)病害，該病特征感病植物葉片變黃，久旱遇雨，葉片驟然萎蔫，故稱“黃萎病”。大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，其寄主植物多達(dá)660種。其中農(nóng)作物184種，觀賞植物323種，雜草153種。在農(nóng)作物中對棉花、馬鈴薯、茄子、番茄、辣椒等都具有侵染性，且能夠相互轉(zhuǎn)染。而禾木科作物比如水稻、麥類、玉米等以及某些雜草則侵害很少。近年來，黃萎病在我國主產(chǎn)農(nóng)作物區(qū)相繼造成嚴(yán)重危害，黃萎病已成為嚴(yán)重影響我國農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙，尤以落葉型黃萎病為嚴(yán)重。大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)歸屬于淡色菌科叢梗孢輪枝菌屬，具有獨特的形態(tài)學(xué)特征。通過顯微鏡觀察，該菌分生孢子梗細(xì)，數(shù)量少且透明，分生孢子較小，一般為3-6X1. 5-2. Oym,富含黑色微菌核。大麗輪枝菌以微菌核和孢子形態(tài)存在土壤中，條件適宜微菌核和孢子萌發(fā)產(chǎn)生侵染器官，從植物根部侵入進(jìn)入植物體內(nèi)，部分菌體形成單細(xì)胞形態(tài)在植物根莖葉的篩管中傳導(dǎo)和增殖，并分泌毒素，刺激植物細(xì)胞增生，堵塞篩管，引起植物萎蔫。大麗輪枝菌屬土傳性非專性寄生菌，在溫度25_28°C，相對濕度在80%以上，此病容易發(fā)生流行。棉花定植后I個月左右開始，地上部位出現(xiàn)病癥，一直到收獲結(jié)束時持續(xù)發(fā)病。最初，下部葉片局部萎蔫，葉邊上卷。之后，病部由黃白色轉(zhuǎn)為黃色，葉片邊緣變色較多，以小葉脈為中心呈楔形。接下來，變色部位逐漸擴大，整片小葉變黃，慢慢褐變枯死。病害加重時,上部葉片也依次發(fā)病枯死,并導(dǎo)致下部葉片慢性枯萎,剖檢病株葉柄和整,可見導(dǎo)管部有黃褐變。生物防治被認(rèn)為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ闹匾乐畏椒ǎ@得高效拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)。吳獻(xiàn)忠(植物病理學(xué)報，1996,26(3) :281-282)采用等電點聚焦技術(shù)分析棉花黃萎病菌纖維素酶同工酶，分析表明電泳譜帶為8條的均為落葉型菌系。將我國棉花黃萎病菌劃分為3個生理型，即落葉型黃萎菌株致病力最強，占15. 7% ;葉枯型菌株為中等致病力，占54. 2%;黃斑型菌株屬弱致病力，占30.1%。王慧萍等(南京師范大學(xué)報，2005, 28(2) :83-85)篩選了一株抗茄子黃萎病的芽孢桿菌F53，改良后的該菌株發(fā)酵條件對黃萎病菌具有很好的抑菌活性。雷白時(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, 37(2) :672-674)從各地的土樣中分離到84株拮抗細(xì)菌菌株，復(fù)篩得到強抑菌活性的拮抗細(xì)菌7-30菌株。李術(shù)娜(中國農(nóng)學(xué)通報，2009, 25(15) :26-30)考察了拮抗細(xì)菌2_70在棉花體內(nèi)的定殖試驗，結(jié)果表明該菌不僅能在滅菌土和非滅菌土中定殖，而且五個月后仍能保持較高的抑菌活性。關(guān)于黃萎病菌的致病機制，病原菌在植株體內(nèi)產(chǎn)生毒素作用的結(jié)果。在病原菌侵染寄主，即由粘附接觸一入侵一繁殖擴展一顯癥，在這個病理學(xué)過程中，病原菌毒素所扮演的主導(dǎo)作用受到越來越多的研究支持。章元壽(真菌學(xué)報，1991，10(3) :169-181)等越來越多的研究表明，大麗輪枝菌分泌的毒素是導(dǎo)致黃萎病的關(guān)鍵因素，其致萎作用可能是能夠凝固植物細(xì)胞原生質(zhì)體，破壞原生質(zhì)膜的半透性，擾亂棉株的水分平衡，導(dǎo)致植株體內(nèi)脫落酸含量增加，使棉株體內(nèi)膨壓改變，從而引起萎蔫癥狀。在液體培養(yǎng)基中，黃萎病菌分泌毒素，這種毒素可誘發(fā)與黃萎病菌類似的致病癥狀Pegg et al(Nature, 1965，208:1228-1229)。經(jīng)研究表明，大麗輪枝菌產(chǎn)生的毒素是一種糖蛋白復(fù)合體(protein-1 ipopoly-saccharide complex, PLPC),其中的蛋白質(zhì)成分是致萎的活性部分。Nachmias (Physiol. Plant Pathology, 1985，26:43-55)在感病的馬鈴薯中用PLPC的抗血清檢測到了致病抗原毒蛋白的存在，而健康的馬鈴薯中未能檢出。這充分證明PLPC具有內(nèi)源致病作用，直接參與了病原菌的致病過程。Chu et al (The PlantJournal, 1999，9(41) :972-976)報道得到一個26kDa的糖蛋白，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生植保素并能使植物萎蔫。由于研究者的研究方法和手段不同，分離到的許多種毒素蛋白。章元壽等(植物病理學(xué)報，1991，21 (I) :49-52)通過纖維素柱層析和瓊脂糖凝膠層析，得到一個具有致萎活性的峰蛋白，并發(fā)現(xiàn)致病力強的菌株毒素所含的蛋白質(zhì)和多糖的量高于致病力弱 的菌株毒素。呂金殿等(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28(2) :58-65)用親和層析法分離純化毒蛋白，分析顯示，它是一種糖蛋白，其蛋白質(zhì)和糖的含量分別是8. 53%和14.7%。。陳旭升等(江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000, 16:10-14)對3個典型黃萎病菌分泌毒蛋白進(jìn)行層析分離，皆得到兩個致萎蛋白峰，分子量平均值的范圍分別在20kDa和96kDa。傅正擎等(江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，15(4) :211 215)將從棉株體內(nèi)分離獲得的內(nèi)生菌Ala、73a接入棉花黃萎病菌菌株JClB (落葉型)、BP2(非落葉型)的Czapek培養(yǎng)液中，培養(yǎng)不同時間后提取粗毒素，結(jié)果表明對BP2產(chǎn)毒素抑制最強的為Ala菌體，抑制率達(dá)51. 97%;對JClB產(chǎn)毒素能力抑制最強的是73a菌體，抑制率為72. 60% ;液體培養(yǎng)的黃萎病菌加入內(nèi)生菌或代謝物后，其黃萎病菌毒素粗提液對棉苗致萎度下降。查閱國內(nèi)和國外發(fā)表的文章，僅查到關(guān)于大麗輪枝菌毒素的研究，未查到對毒素降解的研究報道；對于植物內(nèi)生細(xì)菌與大麗輪枝菌的研究，僅查到內(nèi)生細(xì)菌加入離體培養(yǎng)的大麗輪枝菌中能夠抑制毒素蛋白的產(chǎn)生，未查到內(nèi)生細(xì)菌與毒素蛋白共同作用，把毒素蛋白降解或者轉(zhuǎn)化成其他蛋白的研究報道。關(guān)于應(yīng)用微生物的功能防治植物黃萎病的公開專利資料201210021045. 8公開了一株棉花內(nèi)生真菌在棉花黃萎病防治中的應(yīng)用；201210099459. 2公開了大麗輪枝菌弱毒株的應(yīng)用；這兩個專利是關(guān)于真菌的應(yīng)用。200810183075. 2和20081083072. 9公開了地衣芽孢桿菌的應(yīng)用；200810183071.4是枯草芽孢桿菌的應(yīng)用；200910192921. I是銅綠芽孢桿菌的應(yīng)用；201110197653.x是固氮菌的應(yīng)用；這五個專利的細(xì)菌分離自植物根際，即根際細(xì)菌的應(yīng)用。有關(guān)植物內(nèi)生細(xì)菌的專利僅查到200510020328. O中的內(nèi)生細(xì)菌誘導(dǎo)馬鈴薯抗病；201110082094. 8中的內(nèi)生細(xì)菌防治松樹枯梢病；201210049875. I中的內(nèi)生細(xì)菌防治水稻稻瘟病；201110377736. 7分離的內(nèi)生細(xì)菌作為土壤修復(fù)劑；201110352670. 6的內(nèi)生細(xì)菌生產(chǎn)防治小麥紋枯病的農(nóng)藥。公開的資料中未查詢通過離體篩選降解毒蛋白的植物內(nèi)生細(xì)菌的方法和應(yīng)用植物內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)通過降解黃萎病菌毒素的方法來防治黃萎病的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內(nèi)生細(xì)菌的獲得方法和在防治植物黃萎病上的應(yīng)用。本專利技術(shù)的研究人員通過對大麗輪枝菌毒素蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳測定證明大麗輪枝菌的發(fā)酵液經(jīng)100°c水浴lh，6層濾紙本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內(nèi)生細(xì)菌的獲得方法，是把從植物體內(nèi)分離得到的植物內(nèi)生細(xì)菌的菌體與大麗輪枝菌毒素混合培養(yǎng)，應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定混合培養(yǎng)后的蛋白條帶與原毒素的蛋白條帶進(jìn)行比較，混合培養(yǎng)體系缺少了26KD蛋白條帶的為目的菌株。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：閆淑珍，陳雙林，許芳，
申請(專利權(quán))人：南京師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：