一種提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法，它涉及一種提高體細胞胚誘導率的方法。它要解決現有水曲柳體細胞胚胎發生技術中存在體細胞胚誘導率低、外植體取材受季節和地點限制、外植體來源不足的問題。方法：一、取水曲柳成熟種子消毒后進行誘導培養，得胚性組織；二、胚性組織進行繼代培養，即完成。本發明專利技術成本低、操作簡單，使體細胞胚誘導率提高到70％以上，單個外植體上的體細胞胚數量達70個以上。本發明專利技術可以實現提高水曲柳體細胞胚誘導率、增加體細胞胚數量、提高繁殖效率的目標，而且本發明專利技術具有外植體來源廣泛，包括新采集的成熟種子、經過各種方法貯藏不同時間的成熟種子均可作為外植體、外植體取材不受季節和地點限制的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種提高體細胞胚誘導率的方法。
技術介紹
水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)屬木犀科白臘樹屬，是我國東北重要的經濟和生態用樹種之一。水曲柳材質優良，強度適中，紋理美觀，木材利用價值極高，是著名的軍事用材和高級家具用材，與胡桃楸、黃菠蘿同稱為“東北三大硬闊”。同時，水曲柳是東北林區頂級群落紅松針闊混交林的重要伴生樹種之一。然而，水曲柳的資源歷來非常缺乏，カロ之長期的過渡采伐和不合理利用，其資源已將近枯竭，生態環境問題日益嚴重。另外水曲柳母樹結實情況受環境條件影響很大，種子的供應常有不足。水曲柳體細胞胚胎發生技術為解決水曲柳種子匱乏和水曲柳優良品系種質保存 的問題提供了ー個重要的方法和手段。然而水曲柳體細胞胚胎發生還存在很多困難，比如體細胞胚的誘導率和轉換率低等問題。目前，水曲柳胚性組織的誘導主要是利用未成熟合子胚(以授粉后9周左右采集的未成熟合子胚為最佳外植體)，體細胞胚誘導率平均在30 35%。并且存在外植體取材時期受季節(毎年7月中旬左右，即授粉后9周)和地點(水曲柳母樹林或種子園)限制、外植體來源不足(水曲柳母樹結實具有大小年和結實間隔期)等問題。若采用成熟合子胚為外植體，則具有易于取材、不受時間地點限制等優點，易于大規模產業化繁殖。但在現有的技術中，以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細胞胚誘導率最高才15 %，不能滿足水曲柳體細胞胚大規模誘導和培養的需求,無法實現水曲柳體細胞胚的エ廠化和自動化生產。因此，迫切需要改進現有的水曲柳體細胞胚誘導技木，以提高水曲柳體細胞胚的誘導率，實現水曲柳優良品系的大規模產業化繁殖。
技術實現思路
本專利技術目的是為了解決現有水曲柳體細胞胚胎發生技術中存在體細胞胚誘導率低、外植體取材受季節和地點限制、外植體來源不足的問題，而提供。提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法按以下步驟實現一、取水曲柳成熟種子進行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤(BA)、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、75 125g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的誘導培養基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下培養2 4周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、0 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的繼代培養基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下繼續培養2 4周，得各種不同發育時期的體細胞胚，即完成提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法；其中步驟一中誘導培養基為MS1/2培養基或WPM培養基，pH值均為5 6 ;步驟一中生長素為2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4_D)或萘こ酸(NAA)；步驟ニ中繼代培養基為MS1/2培養基或MS培養基，pH值均為5 6 ;步驟ニ中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸。本專利技術中提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法成本低、操作簡單，通過調節體細胞胚誘導培養基中的蔗糖濃度或甘露醇濃度，可調節培養基的滲透壓，進而實現對水曲柳體細胞胚誘導率提高的物理調控，使體細胞胚誘導率提高到70%以上(現有的技術中以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細胞胚誘導率最高才15% )，單個外植體上的體細胞胚數量達70個以上。本專利技術可以實現提高水曲柳體細胞胚誘導率、増加體細胞胚數量、提高繁殖效率 的目標，而且本專利技術具有外植體來源廣泛，包括新采集的成熟種子、經過各種方法貯藏不同時間的成熟種子均可作為外植體、外植體取材不受季節和地點限制的特點。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法按以下步驟實現一、取水曲柳成熟種子進行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、75 125g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的誘導培養基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下培養2 4周，得胚性組織；ニ、將胚性組織接種到含0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、0 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖和6 7g/L瓊脂的繼代培養基中，在溫度為20 30°C、濕度為40% 70%、無光照的條件下繼續培養2 4周，得各種不同發育時期的體細胞胚，即完成提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法；其中步驟一中誘導培養基為MS1/2培養基或WPM培養基，pH值均為5 6 ;步驟一中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸；步驟ニ中繼代培養基為MS1/2培養基或MS培養基，pH值均為5 6 ;步驟ニ中生長素為2，4_ ニ氯苯氧こ酸或萘こ酸。本實施方式步驟*中水曲柳成熟種子為毎年9月下旬至10月下旬采集的成熟種子或采集后經過不同方法貯藏后的水曲柳成熟種子；本實施方式中步驟一中誘導培養基滲透壓的調節是通過在誘導培養基中添加75 125g/L鹿糖或添加20 30g/L鹿糖和55 140g/L甘露醇實現的。本實施方式中誘導培養基和繼代培養基均經過121°C滅菌20min，自然冷卻。本實施方式步驟一中MS1/2培養基為所有元素含量都減半的MS培養基。本實施方式中涉及的MS培養基、MS1/2培養基和WPM培養基的成分如表I所示。表I具體實施方式ニ 本實施方式與具體實施方式一的不同是，步驟一中水曲柳成熟種子進行消毒處理的方法剝除包被在種子外面的果皮，流水沖洗種子20 40min，然后在25 30°C的室溫下將種子在水中浸泡2 3天,每天換一次水；然后在超凈工作臺上用體積濃度為70 % 80 %的酒精浸泡種子30 120s，然后用體積濃度為2 % 6 %的NaClO溶液浸泡種子10 20min進行體表滅菌，再用無菌水沖洗浸泡后的種子3 7次。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同是，步驟一中剝離出合子胚的方法在超凈工作臺上用無菌解剖刀在成熟種子的胚根端切去1/3 1/2，用鑷子從切ロ處擠出成熟合子胚，切取成熟合子胚的單片子葉接種到誘導培養基上，且子葉內側附于培養基上。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同是，步驟一中切取合子胚的單片子葉還可以接種到含I. 0 2. Omg/L芐基腺嘌呤、2. 5 5. Omg/L生長素、200 700mg/L酸性水解酪蛋白、20 30g/L蔗糖55 140g/L甘露醇和6 7g/L瓊脂的誘導培養基中。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同是，步驟ニ中在溫 度為24°C、濕度為50%、無光照的條件下繼續培養3周，得各種不同發育時期的體細胞胚。其它步驟及參數與具體實施方式一相同。實施例I :提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法按以下步驟實現一、取水曲柳成熟種子進行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含2. Omg/L芐基腺嘌呤、5. 0mg/L2,4- ニ氯苯氧こ酸、400mg/L酸性水解酪蛋白、75g/L蔗糖和6g/L瓊脂的MS1/2培養基本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法，其特征在于它按以下步驟實現：一、取水曲柳成熟種子進行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含1.0～2.0mg/L芐基腺嘌呤、2.5～5.0mg/L生長素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、75～125g/L蔗糖和6～7g/L瓊脂的誘導培養基中，在溫度為20～30℃、濕度為40％～70％、無光照的條件下培養2～4周，得胚性組織；二、將胚性組織接種到含0～2.0mg/L芐基腺嘌呤、0～5.0mg/L生長素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、20～30g/L蔗糖和6～7g/L瓊脂的繼代培養基中，在溫度為20～30℃、濕度為40％～70％、無光照的條件下繼續培養2～4周，得各種不同發育時期的體細胞胚，即完成提高水曲柳體細胞胚誘導率的方法；其中步驟一中誘導培養基為MS1/2培養基或WPM培養基，pH值均為5～6；步驟一中生長素為2，4?二氯苯氧乙酸或萘乙酸；步驟二中繼代培養基為MS1/2培養基或MS培養基，pH值均為5～6；步驟二中生長素為2，4?二氯苯氧乙酸或萘乙酸。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊玲，
申請(專利權)人：東北林業大學，楊玲，
類型：發明
國別省市：
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