細菌耐藥基因檢測方法、基因芯片和試劑盒技術

本發明專利技術公開了一種細菌耐藥基因檢測方法、基因芯片和試劑盒。該試劑盒包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測探針。該基因芯片包括檢測待測細菌耐藥基因的探針。利用該試劑盒和基因芯片進行耐藥基因檢測的方法，包括步驟：1)利用試劑盒中的引物，PCR擴增待測樣本DNA中的耐藥基因；2)擴增產物與試劑盒中的檢測探針進行熒光標記反應；3)熒光標記的擴增產物與基因芯片進行雜交，確定樣本所含耐藥基因。本發明專利技術的檢測方法覆蓋了臨床最常見的16種耐藥基因的檢測，有助于實現臨床細菌耐藥情況的快速診斷，從而可以為臨床合理選擇治療藥物提供支持。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫學領域，特別是涉及一種檢測臨床常見細菌耐藥基因的方法。本專利技術還涉及用于該方法的試劑盒和基因芯片。
技術介紹
全國細菌耐藥監測網的統計顯示，在耐藥細菌中，革蘭氏陰性菌占70%左右，其中以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌為多，且多重耐藥情 況嚴重；革蘭氏陽性菌占30%左右，其中，葡萄球菌屬占到2/3，而金黃色葡萄球菌幾乎占葡萄球菌屬的一半，腸球菌屬占革蘭氏陽性菌的1/4左右，并以糞腸球菌和屎腸球菌為主。隨著感染性疾病的增多，第三代和第四代頭孢菌素、碳青霉烯類以及氟喹諾酮類等超廣譜抗菌藥物被廣泛使用，細菌的耐藥情況變得日益嚴重，造成感染性疾病難以控制、易復發、術后感染率高、昂貴抗菌藥物使用量增加等后果。耐藥菌株還隨著國際交流在全球范圍蔓延。傳統的病原學診斷及其耐藥性檢測主要依賴于形態學、培養等方法，需要先從標本中培養分離到病原菌，然后測定細菌的藥物敏感性，測定的方法主要包括定性測定的紙片擴散法、K-B法，定量測定的稀釋法(如肉湯稀釋法，瓊脂稀釋法)，E試驗法以及全自動藥敏儀法，這些方法的成本相對較低，但測定過程復雜，耗時長。目前，臨床上也有應用全自動微生物鑒定及藥敏分析系統來做耐藥檢測，但同樣需要經歷培養、分離提純、鑒定三個步驟，最順利的情況也需要72小時才能提供藥敏結果，且難以對自身生長緩慢、生長條件苛刻的細菌進行檢測。此外，血清免疫學方法也可用于細菌的耐藥性檢測，但其假陽性率和假陰性率高，重復性差，效能也不高。鑒于臨床治療的需要，醫生往往先根據流行病學資料、臨床癥狀、體征及影像學特征等，估計可能的病原體及藥敏情況，經驗性應用覆蓋可能病原體的抗菌藥物或者相對廣譜的抗菌藥物，待培養結果出來后，再對抗菌藥物進行調整，這嚴重限制了臨床醫師為患者及時有效地選擇敏感抗菌藥物，尤其不利于重癥感染性疾病的及時治療，而且很可能存在抗生素濫用的問題，助長了耐藥菌的產生。通過檢測細菌的耐藥基因，實現臨床上耐藥菌的快速準確診斷，是目前臨床微生物學的重要研究和發展方向，它對控制醫院內感染和搶救重癥感染病人具有重要的意義。β -內酰胺酶的產生是細菌對β -內酰胺類抗生素耐藥的主要機制。β -內酰胺酶可由染色體和質粒介導，數量超過200種，其中，超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)超過50種，遍布于世界各地。ESBLs的產生，是革蘭氏陰性腸桿菌的主要耐藥機制。在醫院感染中，ESBLs所涉及的菌種，幾乎涵蓋了所有主要的革蘭氏陰性桿菌。質粒介導的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因，包括qnr(quinolone resistance)、qepA(quinolone efflux protein A)和 aac (6’)-Ib-cr 等。質粒通過接合等方式，在細菌間傳遞耐藥基因，造成耐藥性的傳播?；騛ac (6’ )-Ib的304位T突變為C或者A，或者535位G突變為T，導致102位色氨酸突變為精氨酸，179位天冬氨酸突變為酪氨酸，引起細菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性。DNA回旋酶GyrA和拓撲異構酶ParC的突變是導致細菌對喹諾酮類耐藥的重要機制，GyrA基因常見突變位點有83位絲氨酸(S83)突變為亮氨酸(L83)、87位天冬氨酸(D87)突變為天冬酰胺(N87)或者酪氨酸(Y87) ;ParC常見突變位點有80位絲氨酸(S80)突變為異亮氨酸(180)、84位谷氨酸(E84)突變為賴氨酸(K84)、甘氨酸(G84)或者纈氨酸(V84)。mecA基因是MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)特有的耐藥基因，其編碼的PBP2a蛋白代替原來的青霉素結合蛋白PBP2，細菌細胞壁的合成不能被抑制，致使β -內酰胺類藥物結合靶位缺失，從而形成耐藥。檢測mecA基因是被認為國內外判斷MRSA的金標準。氨基糖苷類修飾基因aac出’)-Ie-aph (2”)-Ia的存在，是耐高濃度慶大霉素腸球菌(HLGR)的主要原因。目前，臨床微生物耐藥基因的檢測，基本以表型檢測為主。由于耐藥機制的多樣性，某些耐藥基因可能沉默表達，但潛在的耐藥性是存在的，在合適的環境條件下，就會轉·變成耐藥細菌，或者將耐藥基因傳播給其他細菌。PCR雜交分析是檢測細菌耐藥基因最常見的方法，然而，在眾多的耐藥基因中篩選某一種或者幾種耐藥基因，需要做大量的重復工作。基因芯片技術，具有敏感性高、特異性強、快速、高通量等特性，與PCR雜交分析法相比，基因芯片可并行檢測多種基因信息，實現大量重復工作的同步化，從而能提高檢測效率。針對細菌耐藥基因的檢測，國內外研究者嘗試了不同檢測范圍的基因芯片。例如，Jan Weile等開發了一種檢測銅綠假單胞菌抗生素耐藥性和毒力因子的基因芯片，整個過程在5個小時內完成，陽性預測值、陰性預測值、靈敏度、特異度分別為78%、91%、89 %>83 % (ffeile J et al. DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates. Diagn Microbiol Infect Dis,2007,59(3) :325-338)。Miranda Batchelor等開發的革蘭氏陰性桿菌耐藥基因的微型芯片可以檢測編碼耐氨基糖苷類、甲氧芐啶、磺胺類、四環素和內酰胺類以及超廣譜β _ 內酸胺酶的 47 個耐藥基因(Batchelor M et al. Development of a miniaturisedmicroarray-based assay for the rapid identification of antimicrobial resistancegenes in Gram-negative bacteria.Int J Antimicrob Agents,2008,31 (5)440-451)。Naas等設計的芯片能檢測腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌中各型β-內酰胺酶類耐藥基因，包括 TEM、SHV、CTX-M、KPC 等(Naas T et al. Evaluation of a DNAmicroarray,the check-points ESBL/KPC array,for rapid detection of TEM, SHV,andCTX-M extended-spectrum beta-lactamases and KPCcarbapenemases. AntimicrobAgents Chemother. 2010, 54 (8) :3086-3092)。Marco Cassone 等設計制作了覆蓋 8 種細菌的65個大環內酯類耐藥基因的芯片(Cassone M et al. DNA microarray for detectionof macroIide resistance genes. Antimicrob.Agents Chemother,2006,50 (6)2038-2041)。我國的基因芯片技術近年來也發展較快，例如，毛紅菊等設計了可以檢測超廣譜β內酞胺酶類耐藥基因中的SHV、CTX-M的幾個亞型的基因芯片，該方法由標本處理到細菌鑒定及本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種細菌耐藥基因檢測試劑盒，其特征在于：包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測所述細菌耐藥基因的探針；所述引物具有如SEQ?ID?No：1～32所示的序列或其互補鏈；所述探針具有如SEQ?ID?No：33～61所示的序列或其互補鏈。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡挺，張春秀，張順，陳金絲，李巧云，周佳菁，肖華勝，
申請(專利權)人：寧波市第二醫院，上海生物芯片有限公司，上海伯豪生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：