用于連接鋅指模塊的組合物制造技術(shù)

本文中公開了用于連接DNA結(jié)合模塊以允許與由1個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)分隔的模塊子位點(diǎn)特異性和選擇性結(jié)合的組合物。還描述了制造和使用包含這些接頭的組合物的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本公開屬于基因組和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。·背景具有經(jīng)工程化以與所選擇靶位點(diǎn)結(jié)合的識(shí)別區(qū)的鋅指蛋白常規(guī)上與其他鋅指蛋白以及與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域連接并且用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)和基因組靶位點(diǎn)。例如，包含與切割結(jié)構(gòu)域有效連接的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人工核酸酶已經(jīng)用于基因組序列的定向改變，包括插入外源序列、使一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因失活、產(chǎn)生具有改變的基因表達(dá)模式的生物(例如，動(dòng)物或作物)和細(xì)胞系等。見，例如，美國專利公布No. 20050064474 ；20060063231 ；20070134796 ；20080015164 和國際公布 No. 2007/139982。鋅指蛋白模塊(例如，一個(gè)或多個(gè)指狀物的工程化鋅指)一般使用5個(gè)氨基酸的“規(guī)范”接頭序列如TGEKP (SEQ ID NO: I)或較長柔性接頭彼此連接。見，美國專利No. 6，479，626 ;6，903，185 ;7，153，949 和美國專利公布 No. 20030119023。然而，借助這些規(guī)范接頭連接的鋅指蛋白模塊僅在靶核酸分子中連接的模塊靶子位點(diǎn)之間不存在空位時(shí)才最有效地結(jié)合。另外，就結(jié)合作用而言，設(shè)計(jì)成允許連接的模塊與帶有1、2或3個(gè)堿基對(duì)空位的靶位點(diǎn)結(jié)合的前述柔性長接頭不在這些不同的堿基對(duì)空位之間區(qū)分。見，美國專利 No. 6，479，626 ;6，903，185 ;7，153，949 和美國專利公布 No. 20030119023。因此，仍需要用于使鋅指模塊彼此連接的方法和組合物，從而改善蛋白質(zhì)跨越1、2或3bp模塊間空位的親和力，以及改善這些蛋白質(zhì)結(jié)合跨越期望長度的空位的靶并且不與沒有這種期望長度的空位的其他靶進(jìn)行非選擇性結(jié)合的選擇性。用于在相鄰模塊子位點(diǎn)之間區(qū)分0、1、2、3個(gè)或甚至更多個(gè)堿基對(duì)空位的鋅指模塊的接頭將允許任何鋅指融合蛋白(包括鋅指轉(zhuǎn)錄因子(ZFP-TF)和鋅指核酸酶(ZFN))的更大設(shè)計(jì)能力。專利技術(shù)簡述本文中公開了用于使DNA結(jié)合模塊(例如，鋅指模塊)此次連接的接頭。另外，描述了包含這些接頭的融合蛋白，例如鋅指蛋白，所述融合蛋白轉(zhuǎn)而與調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域)或與核酸酶融合。本公開還提供了使用這些融合蛋白及其組合物用于在細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)、定向切割目的區(qū)域內(nèi)細(xì)胞DNA(例如，內(nèi)源細(xì)胞染色質(zhì))和/或在預(yù)定目的區(qū)域同源重組的方法。因此，在一個(gè)方面中，本文中描述了在氨基(N)端指狀物的最末殘基(一般是羧基(C)端鋅配位殘基)和C端指狀物的第一殘基(一般是第一(N端)保守芳族殘基)之間包含5個(gè)或更多個(gè)氨基酸(例如7-17個(gè)氨基酸)的接頭。在某些實(shí)施方案中，接頭包含N端殘基、C端殘基和相對(duì)于末端殘基為內(nèi)部的殘基，并且進(jìn)一步地其中所述N端殘基或內(nèi)部殘基包含至少一個(gè)脯氨酸殘基，例如包含氨基酸序列x_-xn-x_的接頭，其中X是任何氨基酸殘基，Xn包含至少3個(gè)氨基酸殘基并且XNi^P Xn的至少一者包含脯氨酸殘基。在某些實(shí)施方案中，接頭包含至少兩個(gè)脯氨酸殘基(例如，2、3、4個(gè)或更多個(gè))。在其他實(shí)施方案中，接頭包含至少一個(gè)脯氨酸殘基和至少一個(gè)堿性殘基(例如，Arg、His或Lys)。在其他實(shí)施方案中，接頭包含至少兩個(gè)堿性殘基(例如，Arg、His或Lys)。在某些實(shí)施方案中，接頭是在表4、5、6、9、10、11或13的任一表中顯不的一個(gè)接頭。在另一個(gè)方面，提供了包含如本文所述的接頭的融合多肽。在另一個(gè)方面，提供了編碼如本文所述的任一種接頭或融合蛋白的多核苷酸。 在又一個(gè)方面，也提供了包含任一種如本文所述的多肽(例如，融合多肽)和/或多核苷酸的細(xì)胞。在又一個(gè)方面，也提供了包含如本文所述的多肽(例如，融合多肽)和/或多核苷酸的生物(例如，哺乳動(dòng)物、真菌和植物)。可以在細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，例如，通過將融合蛋白輸送至細(xì)胞或通過將編碼融合蛋白的多核苷酸輸送至細(xì)胞來表達(dá)。如果這種多核苷酸是DNA，則將它轉(zhuǎn)錄并翻譯以產(chǎn)生融合蛋白。如果作為RNA分子輸送，則將它立即翻譯，因此產(chǎn)生融合蛋白。在這份公開的其他地方提出了用于輸送多核苷酸和多肽至細(xì)胞的方法。根據(jù)作為整體的公開內(nèi)容，這些方面和其他方面將對(duì)技術(shù)人員是輕易顯而易見的。附圖簡述圖I，小圖A和小圖B,顯不不例性鋒指蛋白和接頭的氣基序列。圖IA顯不用于這些研究的每種宿主ZFP的氨基酸序列(ZFP 8196的F1-F4在SEQ ID NO: 130 ；SEQ IDNO: 131 ；SEQ ID NO: 132 和 SEQ IDNO: 133 中顯示；ZFP 7263 的 Fl 至 F4 在 SEQ ID NO: 134 ；SEQ IDNO: 135 ；SEQ ID NO: 136 和 SEQ ID NO: 137 中顯示；ZFP 7264 的 Fl 至 F4 在 SEQ IDNO: 138 ；SEQ ID NO: 139 ；SEQ ID NO: 140 和 SEQ IDNO: 141 中顯示)。氨基酸由單字母代碼命名。每一個(gè)序列以氨基端一羧基端方向列出，因此每種蛋白質(zhì)的氨基端是指狀物I的第一甲硫氨酸，并且羧基端是指狀物4的最末絲氨酸。“F1”、“F2”、“F3”和“F4”分別指每種蛋白質(zhì)的第一、第二、第三和第四指狀物。加下劃線部分表示指狀物交界處常規(guī)上視為接頭序列的氨基酸殘基。將識(shí)別螺旋加框表示。圖IB顯示接頭文庫設(shè)計(jì)，其中通過將中央接頭中的兩個(gè)或三個(gè)殘基的密碼子替換為2個(gè)至12個(gè)充分隨機(jī)化的密碼子的混合物而產(chǎn)生每個(gè)文庫。文庫密碼子由(NNS) 2_12代表。圖2，小圖A至小圖D，是描述具有所示鋅指蛋白和接頭的噬菌體匯集物的空位選擇性的圖。圖2A顯示了使用帶有Ibp插入堿基的靶(ATAAACTGdCAAAAGGC(SEQ ID NO:33)(表2A))選自ZFP8196文庫的噬菌體匯集物，其中測試所述噬菌體匯集物與表2C中每個(gè)ZFP8196靶的結(jié)合。圖2B顯示了使用帶有Ibp插入堿基的靶(CCACTCTGhTGGAAGTG(SEQ IDNO: 43)(表2A))選自ZFP7263文庫的噬菌體匯集物，其中測試所述噬菌體匯集物與表2C中每個(gè)ZFP7263靶的結(jié)合。圖2C顯示了使用帶有Ibp插入堿基的靶(TTAAAGCGhGCTCCGAA (SEQID NO: 38)(表2A))選自ZFP7264文庫的噬菌體匯集物，其中測試所述噬菌體匯集物與表2C中每個(gè)ZFP7264靶的結(jié)合。圖2D顯示了使用帶有2bp插入堿基的靶(ATAAACTGdbCAAAAGGC(SEQ ID NO:34)(表2A))選自ZFP8196文庫的噬菌體匯集物，其中測試所述噬菌體匯集物與表2C中每個(gè)ZFP8196靶的結(jié)合。每個(gè)測試還包括排除與DNA非特異性結(jié)合的針對(duì)其他兩個(gè)宿主ZFP的兩個(gè)對(duì)照靶以及不包括靶位點(diǎn)的陰性對(duì)照樣品。顯示了成功結(jié)合每種靶的噬菌體的％。每種噬菌體匯集物來自第五輪選擇。停留效率基本上如先前描述那樣測定(Rebar 等，Methods in Enzymology, 1996 (267) : 129-149)。圖3，小圖A和小圖B，顯示針對(duì)含有所示空位的靶位點(diǎn)所選擇的接頭。圖3A顯示在ZFP8196、ZFP7263和ZFP7264的背景下針對(duì)跨越Ibp空位所選擇的接頭序列(SEQ IDNO: 142至166)。圖3B顯本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·帕斯喬恩，E·J·瑞巴，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：桑格摩生物科學(xué)股份有限公司，
類型：
國別省市：