一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征是，所述的發(fā)酵上罐按8％(v/v)接種量，通氣量1vvm攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為250r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度34度，初始pH值控制在7.2；當(dāng)OD600達(dá)到6-7時，pH值控制為7.4，溶氧DO?20％，升溫至42度加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4小時，完成發(fā)酵周期。本發(fā)明專利技術(shù)工藝具有高穩(wěn)定表達(dá)特點(diǎn)，同時提高了重組人生長激素工程菌的蛋白表達(dá)，提高了發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。可延長發(fā)酵周期。增大放罐體積、提高發(fā)酵罐的利用率、降低發(fā)酵液殘?zhí)菨舛取喂蘅偖a(chǎn)量提高20％左右。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程
，具體涉及一種高密度、高表達(dá)的重組人生長激素發(fā)酵優(yōu)化工藝。
技術(shù)介紹
人生長激素(hGH)是人內(nèi)源性激素，由人腦垂體前葉合成分泌的一種非糖基化蛋白質(zhì)，由191個氨基酸組成，分子量為22Kd.具有調(diào)節(jié)代謝、刺激蛋白質(zhì)合成加速脂肪降解等生理功能，能促進(jìn)骨骼和肌肉的生長發(fā)育，目前治療兒童因內(nèi)源性重組人生長激素缺乏或不足導(dǎo)致的身體矮小特效藥，又因能促進(jìn)傷口愈合，也用于損傷、嚴(yán)重?zé)齻闹委熀屯饪剖中g(shù)中。最初生長激素是從牛和豬腦垂體中提取出來的，治療效果不佳，并且有發(fā)熱、過敏等副作用。化學(xué)合成的方法效率低，沒有實(shí)用價值，因此采用基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)人生長激素是滿足臨床大量需求的主要手段。目前人生長激素已經(jīng)分別在大腸桿菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞中獲得成功表達(dá)。雖然真核表達(dá)系統(tǒng)中重組人生長激素(rhGH)的活性高，但產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，無法滿足臨床的大量需求。大腸桿菌由于生長周期短、表達(dá)量高、成本經(jīng)濟(jì)而成為目前重組人生長激素(rhGH)生產(chǎn)的主要表達(dá)系統(tǒng)。現(xiàn)有技術(shù)的重組人生長激素發(fā)酵工藝，其重組人生長激素工程菌的蛋白表達(dá)率較低，發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率不高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為解決以上不足，本專利技術(shù)提供一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，該工藝通過發(fā)酵溫度和PH等的控制工藝優(yōu)化，提高重組人生長激素工程菌的蛋白表達(dá)，提高發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。本研究主要運(yùn)用大腸桿菌Pet30a(+)表達(dá)載體，菌種為BL21(DE3)，對人生長激素進(jìn)行胞間質(zhì)可溶性表達(dá)，并通過大量試驗(yàn)優(yōu)化工程菌的培養(yǎng)條件，以期實(shí)現(xiàn)工程菌的穩(wěn)定培養(yǎng)和高水品表達(dá)，為重組人生長激素(rhGH)的大規(guī)模生產(chǎn)提供了條件。高密度發(fā)酵在能獲得較高生物量的同時，還可以顯著的提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物濃度。影響高密度發(fā)酵的因素有很多，首先培養(yǎng)溫度是影響菌體生長和調(diào)控細(xì)胞代謝的主要因素之一。較高的溫度有利于細(xì)菌高密度發(fā)酵，低溫培養(yǎng)能提高重組產(chǎn)物的表達(dá)量，而且在不同的培養(yǎng)階段采用不同的培養(yǎng)溫度有利于提高細(xì)菌的生長密度和重組產(chǎn)物的表達(dá)量，并縮短培養(yǎng)周期；其次溶解氧的濃度過低或過高都會影響細(xì)菌的生理代謝，適當(dāng)?shù)娜苎跛接欣诰w的生長和產(chǎn)物的合成，因此有必要考察發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物的臨界溶氧濃度和最佳溶氧濃度，并控制發(fā)酵過程中溶氧濃度在最適范圍內(nèi)；另外誘導(dǎo)時間也是必須考慮的問題。此外還有Ph、培養(yǎng)基組分、比生長速率等影響因素。本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案是：一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，所述的發(fā)酵優(yōu)化工藝如下：1)菌種培養(yǎng)：配制菌種培養(yǎng)基，接入構(gòu)建基因工程菌E.coliBL21-HGH進(jìn)行菌種培養(yǎng)，獲得液體發(fā)酵菌種；2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基：以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，置入發(fā)酵罐中，加入糖及無機(jī)鹽，加入水，調(diào)節(jié)PH值。得到發(fā)酵培養(yǎng)基；3)發(fā)酵：將上述所得發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌之后，按8％(v/v)接種量接入步驟1)所得液體發(fā)酵菌種，通氣量1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為250r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度34度，培養(yǎng)基pH值7.4；進(jìn)入對數(shù)生長期后，控制溶氧濃度至少在20％，當(dāng)pH值降至7.0時候，通過流加26％(v/v)氨水使得pH值維持在7.2-7.4。；當(dāng)OD600達(dá)到6-7時，升溫至42度加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4小時；4)收集菌種：將發(fā)酵液接入管式離心機(jī)，得到菌種，破碎后分離純化得到目標(biāo)蛋白。作為優(yōu)選，所述的一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征是，所述的發(fā)酵上罐按8％(v/v)接種量，通氣量1vvm攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為250r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度34度，初始pH值控制在7.2；當(dāng)OD600達(dá)到6-7時，pH值控制為7.4，溶氧DO?20％，升溫至42度加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4小時，完成發(fā)酵周期。作為優(yōu)選，所述的一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征是，初始培養(yǎng)溫度設(shè)為34度，pH值為7.2時，當(dāng)分批發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)入補(bǔ)料發(fā)酵階段，采用近指數(shù)流加方式，控制比生產(chǎn)速率在0.25/h。作為優(yōu)選，所述的一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征是，所述的溶氧DO通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速及空氣流量，將DO分別控制為20％。本專利技術(shù)有益效果：本專利技術(shù)生產(chǎn)工藝簡便，便于推廣，同時利用周質(zhì)腔分泌表達(dá)，具有較高生物活性；周質(zhì)腔中蛋白水解酶相對較少，提高了重組蛋白的穩(wěn)定性；消除了被分泌蛋白對細(xì)胞本身毒性作用；表達(dá)蛋白易于后續(xù)的分離純化，使大規(guī)模重組人生長激素表達(dá)為可能。本專利技術(shù)工藝具有高穩(wěn)定表達(dá)特點(diǎn)，同時提高了重組人生長激素工程菌的蛋白表達(dá)，提高了發(fā)酵設(shè)備和原料的利用率。可延長發(fā)酵周期。增大放罐體積、提高發(fā)酵罐的利用率、降低發(fā)酵液殘?zhí)菨舛取喂蘅偖a(chǎn)量提高20％左右。為使更進(jìn)一步了解本專利技術(shù)的特征和
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
，詳見本專利技術(shù)附圖和實(shí)施方式，然而所示附圖和實(shí)施方式僅供參考與說明用，并非是對本專利技術(shù)加以限制。【附圖說明】圖1，本專利技術(shù)發(fā)酵罐PH值影響圖；圖2，本專利技術(shù)30L發(fā)酵罐不同PH各時間段誘導(dǎo)OD600測量值；圖3，本專利技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)溫度影響圖；圖4，本專利技術(shù)實(shí)施例2溫度誘導(dǎo)方案一效果圖；圖5，本專利技術(shù)實(shí)施例2溫度誘導(dǎo)方案二效果圖；【具體實(shí)施方式】下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本專利技術(shù)做詳細(xì)說明：實(shí)施例1，PH值額定優(yōu)化，三角瓶培養(yǎng)測定PH法：將100mlLB液體培養(yǎng)的pH分別調(diào)至6.0、6.5、7.0和8.0加入終濃度為100ug/ml的青霉素，按照5％的接種量接種種子培養(yǎng)液后，34度，200r/min震蕩培養(yǎng)12小時，定時取樣測OD600.發(fā)酵罐測定PH法：培養(yǎng)溫度設(shè)定為34度，初始PH值為7.2，當(dāng)分批發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)入補(bǔ)料階段，采用近指數(shù)流加方式，控制生長速率在0.25/h，培養(yǎng)3小時后升溫至42度誘導(dǎo)，PH分別控制在7.1、7.2、7.3、7.4、7.5，定時測定OD600.通過三角瓶培養(yǎng)取樣測OD600，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PH值為7.5時對菌株發(fā)酵最后合適，同時通過對30L罐進(jìn)行了中試生產(chǎn)，中試檢測結(jié)果表明PH值7.4，菌株生長最為旺盛，見附圖1和2.實(shí)施例2，發(fā)酵溫度的優(yōu)化，將100mlLB液體培養(yǎng)基按照5％的接種量接種后分別在33、35、36、37度搖床振蕩培養(yǎng)至OD600?0.6-0.8后，升至42度誘導(dǎo)表達(dá)。搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)前生長溫度的確定：在一定的溫度范圍內(nèi)，苗體生長速率隨溫度的增高而增大，發(fā)酵周期縮短，因而在實(shí)踐中，在以不降低外源蛋白表達(dá)量的前提下，盡可能提高菌體生長溫度。分別在34、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，所述的發(fā)酵優(yōu)化工藝如下：1)菌種培養(yǎng)：配制菌種培養(yǎng)基，接入構(gòu)建基因工程菌E.coliBL21？HGH進(jìn)行菌種培養(yǎng)，獲得液體發(fā)酵菌種；2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基：以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，置入發(fā)酵罐中，加入糖及無機(jī)鹽，加入水，調(diào)節(jié)PH值。得到發(fā)酵培養(yǎng)基；3)發(fā)酵：將上述所得發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌之后，按8％(v/v)接種量接入步驟1)所得液體發(fā)酵菌種，通氣量1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為250r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度34度，培養(yǎng)基pH值7.4；進(jìn)入對數(shù)生長期后，控制溶氧濃度至少在20％，當(dāng)pH值降至7.0時候，通過流加26％(v/v)氨水使得pH值維持在7.2？7.4；當(dāng)OD600達(dá)到6？7時，升溫至42度加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4小時；4)收集菌種：將發(fā)酵液接入管式離心機(jī)，得到菌種，破碎后分離純化得到目標(biāo)蛋白。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組人生長激素工程菌的發(fā)酵優(yōu)化工藝，所述的發(fā)酵優(yōu)化工藝如下：
1)菌種培養(yǎng)：配制菌種培養(yǎng)基，接入構(gòu)建基因工程菌E.coli
BL21-HGH進(jìn)行菌種培養(yǎng)，獲得液體發(fā)酵菌種；
2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基：以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，置入發(fā)酵罐中，加入糖
及無機(jī)鹽，加入水，調(diào)節(jié)PH值。得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
3)發(fā)酵：將上述所得發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌之后，按8％(v/v)接種量接
入步驟1)所得液體發(fā)酵菌種，通氣量1vvm，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)為
250r/min，發(fā)酵培養(yǎng)溫度34度，培養(yǎng)基pH值7.4；進(jìn)入對數(shù)生
長期后，控制溶氧濃度至少在20％，當(dāng)pH值降至7.0時候，通
過流加26％(v/v)氨水使得pH值維持在7.2-7.4；當(dāng)OD600達(dá)
到6-7時，升溫至42度加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4小時；
4)收集菌種：將發(fā)酵液接入管式離心機(jī)，得...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔣路，
申請(專利權(quán))人：杭州路富生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。