本發明專利技術涉及一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin及其純化方法，屬于蛋白純化技術領域。本發明專利技術以蠶蛹作為原料，通過不同的離心方法，超濾，得到含有免疫蛋白的組分，將含有目的蛋白的上清溶液然經過AKTAexplorer10蛋白純化系統中簡單的層析技術分離純化得到目的蛋白Hemolin。本發明專利技術主要是利用了Superdex200和Superdex75凝膠層析，這為天然免疫蛋白的純化提出了一種全新的解決方法，具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及,屬于蛋白質
技術介紹
Hemolin作為昆蟲所特有的一種防御蛋白，在研究昆蟲的免疫機制中有重要的意義。目前對其結構和功能的研究都取得了一定的成果，但是對其在體外的功能研究較少，所以本實驗通過簡單的純化得到較純的Hemolin,進一步研究該蛋白的結構和功能奠定基礎, 也可以在此基礎上對它的結構做更深入的探索。因為基因工程產品的組分復雜、對產品的純度要求較高且蛋白在純化過程中存在聚集變性的趨勢，所以它的制備和純化比一般產品要困難的多。雖然人們普遍使用制備型 HPLC進行基因工程產物的最后一步純化，但由于HPLC具有對軟硬件的要求較高，前期投入大，純化量有限，價格昂貴，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多等缺點。而Superdex 75蛋白純化系統具有純化量大、流速快，負載量較大，層析條件易控制，非特異性吸附小等優點。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的是提供， 該方法以家蠶桿狀病毒感染的蠶蛹為原料，通過多種離心方法得到含有天然免疫蛋白的溶液；將母液進行活性測定后，將活性高的母液脫糖，脫糖溶液與母液按10:1比例通過宏吸的方法過300K膜包去除糖分；將去糖的母液與蛋白提取液按1:2. 5混合，在4°C冰箱中緩慢攪拌過夜；之后通過弱陰離子交換柱(DEAE)初步分離，再通過瓊脂糖凝膠柱 (SuperdexTM 200、SuperdexTM 75 )進一步純化。為達到上述目的，本專利技術提供一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。上述家蠶天然免疫蛋白Hemolin的純化方法,包括以下步驟(1)家蠶免疫蛋白母液的制備；(2)家蠶天然免疫蛋白的分離純化。進一步地，其中步驟(I)中所述家蠶免疫蛋白母液的制備具體包括a.保存于_20°C的蠶蛹與4°C預冷的滅菌ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上勻漿2min,將勻楽液置于冰上停留5 min,重復9次；b.于15000rpm,4°C離心60 min,重復5次,最后一次用4層紗布過濾；c.過濾后的上清液取200mL與水按I:I的體積混合,用O. 22 μ m膜包過濾,重復10次, 上清溶液恢復到200mL的體積；d.步驟c所得上清液于50000rpm,10°C離心40min后，出現的黑團用超濾液重懸進行區帶離心；取樣品300ml進行蔗糖密度梯度離心3h;e.將步驟d離心3h后所得的上清液用質量體積濃度為60%的蔗糖溶液下樣，按35mL/ 管收集，并在每管中取3mL做比活測定。進一步地，其中步驟d中所述樣品的蔗糖密度梯度離心為鋪制pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液200ml，樣品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充滿，22000rpm密度梯度離心3h。進一步地，其中步驟d中所述區帶離心的條件為50000rpm, 10°C離心40min ;樣品為步驟c所得上清液；蔗糖濃度為質量體積濃度。進一步地，其中步驟d中所述pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液的制備方法為將8g NaCl,O.2g KC1、3. 58g Na2HPO4 · 12Η20、0· 27g KH2PO4 溶于 800mL 無菌去離子水中，定容至 IOOOmL即得。進一步地，其中步驟(2)中所述家蠶天然免疫蛋白的分離純化具體包括a.將活性高于26的母液與脫糖組分按1:10的體積比例通過宏吸的方法，過300K膜包去除糖分；b.將去糖的母液與蛋白提取液按1:2.5的體積比混合，在4°C冰箱中緩慢攪拌過夜；c.之后通過弱陰離子交換柱DEAE初步分離，將分離所得的溶液用IOOkD的超濾管進行濃縮；d.瓊脂糖凝膠柱分離，得到8個峰，并將每個不同的峰分批濃縮；e.濃縮含目的蛋白的峰，用瓊脂糖凝膠柱進一步純化得到目的蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。進一步地,其中步驟(d)中所述瓊脂糖凝膠柱為SuperdexTM 200凝膠柱。進一步地,其中步驟(e)中所述瓊脂糖凝膠柱為SuperdexTM 75凝膠柱。本專利技術以蠶蛹作為原料，通過不同的離心方法，超濾，得到含有免疫蛋白的組分， 將含有目的蛋白的上清溶液然經過AKTA explorer 10蛋白純化系統(SuperdexTM 200、 SuperdexTM 75)中簡單的層析技術分離純化得到目的蛋白Hemolin ;此外,本專利技術所選擇的層析條件不但有效地純化了目的蛋白Hemolin,而且有效地防止了標Hemolin的失活變性，最終制備了純度較高的具有天然活性的Hemolin。附圖說明圖I是家蠶天然免疫蛋白Hemolin的弱陰離子交換柱(DEAE)初步分離色譜圖； 圖2A是家蠶天然免疫蛋白Hemolin的弱陰離子交換柱(DEAE)初步分離的SDS-PAGE圖譜之一；其中4、5、17、21、25、32分別對應于分離得到的管子；圖2B是家蠶天然免疫蛋白Hemolin的弱陰離子交換柱(DEAE)初步分離的SDS-PAGE圖譜之二 ；其中37、38、63、73、75、76等等數字分別對應于分離得到的管子；圖3是SuperdexTM 200分離的色譜圖；圖 4A 是 SuperdexTM 200 分離后的 SDS-PAGE 譜圖之一;其中 23、27、31、34、39、41、44、 47分別對應于分離得到的管子；圖 4B 是 SuperdexTM 200 分離后的 SDS-PAGE 譜圖之二 ；其中 52、56、60、66、68、73、75 等數字分別對應于分離得到的管子；圖5是將47號多次收集的樣品濃縮后用SuperdexTM 75分離的色譜圖；圖6是為圖4第一個峰濃縮后的SDS-PAGE鑒定圖；圖7是將圖3中第一塊膠的最后一條泳道中取樣的質譜鑒定圖(一級)；圖8是將圖3中第一塊膠的最后一條泳道中取樣的質譜圖(二級)；圖9是將圖3中第一塊膠的最后一條泳道中取樣的肽段比對數。具體實施方式應該指出，以下具體說明都是事例性的，旨在對本專利技術提供進一步說明，除非另有說明，本文中使用的所有科學和技術術語具有與本專利技術所屬
人員通常理解的含義相同。下面結合附圖和實施例對本專利技術做進一步說明。實施例I :家蠶免疫蛋白母液的制備步驟I :保存于-20°C的蠶蛹(購于浙江中奇生物藥業股份有限公司)與滅菌4°C預冷的ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上勻漿2 min,將勻漿液置于冰上停留5 min,重復9 次；步驟2 :15000 rpm, 4°C離心Ih,棄去上清,用水重懸沉淀，再于15000 rpm,4°C離心Ih, 如此重復5次，最后一次用4層紗布過濾；步驟3 :過濾后的上清液取200mL與水按I: I的體積混合,用O. 22 μ m膜包過濾,重復 10次，上清溶液恢復到200mL的體積；步驟4 :所得上清液于50000rpm, 10°C離心40min后，出現的黑團用超濾液重懸進行區帶離心(50000rpm, 1(TC離心40min);取樣品300ml進行鹿糖密度梯度離心3h (具體操作過程為鋪制PBS (pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液)200ml，樣品(步驟3所得上清液)300ml，30%(質量體積濃度)蔗糖400ml，55% (質量體積濃度)蔗糖充滿，22000rpm密度梯度離心3h);步驟5 :將步驟4離心3本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種家蠶天然免疫蛋白Hemolin,其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。2.—種如權利要求I所述的家蠶天然免疫蛋白Hemolin的純化方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟 (I)家蠶免疫蛋白母液的制備； (2)家蠶天然免疫蛋白的分離純化。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述家蠶免疫蛋白母液的制備具體包括 a.保存于_20°C的蠶蛹與4°C預冷的滅菌ddH20以1:3的重量百分比混合，在冰上勻衆2 min,將勻楽:液置于冰上停留5 min,重復9次； b.于15000rpm,4°C離心Ih,棄去上清,用水重懸沉淀,再于15000 rpm, 4°C離心Ih,如此重復5次，最后一次用4層紗布過濾； c.過濾后的上清液取200mL與水按I:I的體積混合,用O. 22 μ m膜包過濾,重復10次，上清溶液恢復到200mL的體積； d.步驟c所得上清液于50000rpm,10°C離心40min后，出現的黑團用超濾液重懸進行區帶離心；取樣品300ml進行蔗糖密度梯度離心3h; e.將步驟d離心3h后所得的上清液用質量體積濃度為60%蔗糖溶液下樣，按35mL/管收集，并在每管中取3mL做比活測定。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟d中所述樣品的蔗糖密度梯度離心為鋪制pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液200ml，樣品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充滿，22000rpm密度梯度離心3h。5.如權利要求3或4所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張耀洲，杜瑤瑤，劉玲玲，陳劍清，舒特俊，
申請(專利權)人：天津耀宇生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。