本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種來源于非洲芥菜的脂肪酸延長酶及其編碼基因BtFAE1。將該基因?qū)虢湍福亟M酵母芥酸含量達(dá)2.33±0.38％。本發(fā)明專利技術(shù)的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锝嫠徇z傳調(diào)控機(jī)制的研究以及提高植物的芥酸含量和相關(guān)性狀的改良具有重要的理論和實(shí)際意義，將在植物的芥酸基因基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及非洲芥菜 (Brassicatournefortii Gouan)脂肪酸延長酶(FAEl)及其編碼基因。
技術(shù)介紹
芥酸(erucic acid，C22:1)是一種超長鏈不飽和脂肪酸，主要存在于十字花科 (Brassicaceae)和金蓮花科(Tropaeolaceae)植物種子中。作為植物的代謝產(chǎn)物，芥酸還在一定程度上影響植物的生長發(fā)育，在植物與環(huán)境的相互作用中，參與了生物膜角質(zhì)或蠟質(zhì)的合成。從營養(yǎng)價(jià)值來說，芥酸是食用油的抗?fàn)I養(yǎng)成分，不易被人體消化吸收，容易導(dǎo)致冠心病和脂肪肝等病害發(fā)生。然而，在工業(yè)上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有較好的增塑性和疏水性，因此，具有廣泛的用途，是生產(chǎn)潤滑劑、防腐劑、化纖原料和化妝品等化工產(chǎn)品的重要原料。FAEl (Fatty Acid Elongase I)基因是調(diào)控芥酸合成的關(guān)鍵基因，雖然自James等最先從擬南芥中克隆到FAEl基因以來，陸續(xù)有完整的FAEl基因從各種十字花科植物中被分離出來，但目前對(duì)于FAEl基因的克隆僅局限于擬南芥及蕓苔屬少數(shù)幾種植物中，而十字花科是芥酸分布的主要種質(zhì)資源，植物種類多，芥酸含量復(fù)雜，是芥酸合成關(guān)鍵基因克隆的合適材料。本專利技術(shù)通過BtFAEl基因的真核表達(dá)，獲得活性蛋白，同時(shí)脂肪酸含量檢測分析發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白對(duì)芥酸合成有催化活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種來自于芥酸含量較高的非洲芥菜中的脂肪酸延長酶 (Fatty Acid Elongase I, FAE1)及其編碼基因。本專利技術(shù)的非洲芥菜的FAEl基因由1251個(gè)堿基組成，含有一個(gè)完整的開放閱讀框， 為序列表中的I號(hào)序列，將此基因命名為BtFAEl。本專利技術(shù)的非洲芥菜FAEl蛋白由506個(gè)氨基酸組成，開放閱讀框的起始密碼子為 ATG，終止密碼子為TAA。BtFAEl蛋白的理論分子量為56. 51kDa，等電點(diǎn)為9. 63。含有上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸的載體，以及用上述序列I及其開放閱讀框架的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物細(xì)胞，均是本專利技術(shù)需要保護(hù)的內(nèi)容。本專利技術(shù)基因的發(fā)現(xiàn)，使通過轉(zhuǎn)基因來調(diào)控芥酸合成成為可能，對(duì)于培育高芥酸的轉(zhuǎn)基因十字花科作物具有重要意義。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)作進(jìn)一步說明。附圖說明圖I為非洲芥菜基因組DNA圖2為BtFAEl基因全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為真核表達(dá)載體pYES-BtFAEl的構(gòu)建流程圖圖4為載體pYES-BtFAEl的酶切圖譜圖5為酵母中BtFAEl表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot分析具體實(shí)施方式實(shí)施例I、基因BtFAEl的克隆克隆BtFAEl，具體步驟如下一、BtFAEl基因的獲得非洲芥菜在正常條件下栽培，待真葉長出，采集葉片，從葉片中提取DNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終獲得BtFAEl基因。I、非洲芥菜基因組DNA的提取取新鮮幼嫩的活體植物葉片約O. 2g，在液氮冷凍條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入I. 5mL的離心管中，加入500 μ LCTAB提取液，65°C水浴45min，期間顛倒混勻3次；加入500 μ L體積比為24 I的氯仿-異戍醇，混合均勻，12000r · mirT1離心15min ;取上清,加2倍體積無水乙醇，-20°C冰箱中過夜；4000r · mirT1離心15min使DNA沉淀；700 μ L70%乙醇清洗2 次，4000r · mirT1離心lOmin，再用700 μ L無水乙醇清洗I次，4000r · mirT1離心IOmin,得 DNA沉淀晾干；最后加100 μ L去離子水使沉淀溶解。電泳檢測結(jié)果如圖I所示。2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR以上述得到的非洲芥菜基因組DNA為模版，以分別帶有KpnI與BamHI酶切位點(diǎn)的 TFK (5' CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3')與 TRB(5' CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC)為引物，按以下反應(yīng)擴(kuò)增出BtFAEl基因。反應(yīng)體系如下DNA 模版1·0μ1(2·0μβ) IO X PCR Buffer (含 Mg2+)2.0 μ dNTP0.3 μ (10 mM each) 引物 TFGpmol-L-1)2.0 μ 引物 TR^pmol·!/1)2.0 μ ExTaq DNA polymerase0.2 μ (5 U/μΙ) ddH2012.5 μ 按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng) 先94°C預(yù)變性3min ;然后94°C變性30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。電泳檢測PCR產(chǎn)物，如圖2所示，有一大小約1500bp大小的條帶,與理論值相符。回收1500bp的條帶，將該DNA片段連接到pMD18_T載體上，生成pMD_BtFAEl重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，經(jīng)測序后在GenBank中進(jìn)行Blastn比較，結(jié)果表明，該DNA與多種植物FAEl基因有較高的同源性，因此推測所擴(kuò)增的DNA為一個(gè)FAEl基因。測序后進(jìn)行 BLAST檢索，結(jié)果表明已分離得非洲芥菜FAEl基因序列。二、BtFAEl基因的同源性分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析為將非洲芥菜的FAEl基因的蛋白序列與其他高等植物的FAEl基因編碼的蛋白進(jìn)行同源性分析，從NCBI網(wǎng)站上檢索到擬南芥(Arabidopsis thaliana),芥菜(Brassica juncea),歐洲油菜(Brassica napus),花椰菜(Brassica oleracea),完青(Brassica rapa), Camelina hispida, Cardamine graeca,海甘藍(lán)(Crambeabyssinica),蔣藍(lán)(Isatis tinctoria),綠獨(dú)行菜(Lepidium campestre),銀扇草(Lunaria annua),白芥(Sinapis alba),中歐芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通過Megalign軟件分析結(jié)果表明非洲芥菜FAEl蛋白的氨基酸序列與歐洲油菜中FAEl蛋白的同源性達(dá) 96. 4%，與其它幾種植物的同源性在80% -90%左右，與擬南芥的FAEl蛋白同源性最低，僅為 80. 9%。Pfam結(jié)果顯示BtFAEl基因所編碼蛋白具有典型的FAEl蛋白特有的FAE1_CUT1_ RppA 與 ACP_syn_III_C 結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例2、BtFAEl基因的功能驗(yàn)證一、BtFAE I基因在酵母中的高效表達(dá)為了表明BtFAEl基因的編碼功能，本專利技術(shù)將BtFAEl基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位點(diǎn)之間，并轉(zhuǎn)化酵母菌株InvScl，獲得了高效表達(dá)。本專利技術(shù)是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn) BtFAEl的高效表達(dá)的。本實(shí)驗(yàn)采用的酶切位點(diǎn)使pYES2/NT C表達(dá)載體表達(dá)出的產(chǎn)物5’端附加6個(gè)連續(xù)His的融合蛋白，這6個(gè)連續(xù)的His構(gòu)成了 i-NTA凝膠特異結(jié)合的位點(diǎn)，因此可利用親和層析來純化表達(dá)產(chǎn)物。將攜帶BtFAEl基因的pMD_BtFAEl重組載體與pYES2/NT C表達(dá)載體用相同的酶 (BamHI和KpnI)酶切本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種脂肪酸延長酶多肽，該多肽選自：(a)具有序列2氨基酸序列的多肽；(b)將序列2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延長酶功能的多肽。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種脂肪酸延長酶多肽，該多肽選自 (a)具有序列2氨基酸序列的多肽； (b)將序列2氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延長酶功能的多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述脂肪酸延長酶的編碼基因，其特征在于所述脂肪酸延長酶的基因cDNA為下述核苷酸序列之一 (a)序列表中序列I的核苷酸序列； (b)與多核...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫小芹，杭悅宇，李瑩，李密密，龐慧，郭建林，嚴(yán)琴琴，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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