通過(guò)N端增加二硫鍵提高米曲霉木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提出了一種新型的利用計(jì)算機(jī)技術(shù)與生物信息學(xué)方法對(duì)常溫的木聚糖酶進(jìn)行定向改造的方法，運(yùn)用基因工程的方法構(gòu)建具有高效表達(dá)能力的雜合木聚糖酶工程菌。將來(lái)源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的常溫木聚糖酶基因進(jìn)行熱穩(wěn)定性定向改造，獲得了一種雜合木聚糖酶，其熱穩(wěn)定性有了一定的提高，相對(duì)于原酶而言活性沒(méi)有降低，作為一種耐熱型的酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常溫木聚糖酶(AoXynllA)基因進(jìn)行熱穩(wěn)定性定向改造，雜合木聚糖酶工程菌的構(gòu)建及重組雜合木聚糖酶的高效表達(dá)的方法，屬于生物工程
技術(shù)介紹
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一類(lèi)重要的工業(yè)用酶。它主要是作用于木聚糖主鏈,隨機(jī)地切開(kāi)木聚糖內(nèi)部的木糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶。近幾年，由于木聚糖酶在飼料工業(yè)、食品加工及釀造等行業(yè)具有潛在的工業(yè)應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，尤其是在工業(yè)造紙上的應(yīng)用，減少因漂白產(chǎn)生的環(huán)境污染，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。然而在許多工業(yè)中，木聚糖酶都需要在高溫條件下進(jìn)行操作，因此對(duì)木聚糖酶耐熱性的研究也引起了國(guó)內(nèi)外研究的高度重視。開(kāi)發(fā)耐熱型木聚糖酶的研究主 要包括篩選超耐熱的木聚糖酶生產(chǎn)菌和利用基因工程對(duì)酶分子進(jìn)行定向改造，相對(duì)于篩菌技術(shù)的盲目性，后者具有更強(qiáng)的針對(duì)性，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的親睞。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析，可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量較小，且結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，更適合作為理論研究的分子模型，可以用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統(tǒng)及蛋白質(zhì)分子折疊機(jī)理等的研究。基因工程技術(shù)、生物信息學(xué)以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的快速發(fā)展，為分子生物學(xué)的研究開(kāi)辟了新的前景。我們可以運(yùn)用大規(guī)模高性能的計(jì)算機(jī)及其相關(guān)軟件，結(jié)合基因工程手段，利用模擬試驗(yàn)對(duì)酶分子進(jìn)行定向改造以提高熱穩(wěn)定性，加速木聚糖酶在各種領(lǐng)域中的應(yīng)用過(guò)程。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種新型的利用計(jì)算機(jī)技術(shù)與生物信息學(xué)方法對(duì)常溫的木聚糖酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，運(yùn)用基因工程的方法構(gòu)建雜合木聚糖酶工程菌以及重組雜合木聚糖酶的高效表達(dá)的方法。將源自A.oryzae CICC 40186的第11家族的木聚糖酶命名為AoXynllA，其相應(yīng)的基因命名為AoxynllA ;采用的模板為同家族的超耐熱木聚糖酶，將其命名為EvXynllTS,基因序列為本實(shí)驗(yàn)室合成基因Syxynll (GenBank accessionNO. JX459567);由定向改造得到的雜合木聚糖酶命名為AoXynIIA1，其相應(yīng)的基因?yàn)锳oXynllA1，其熱穩(wěn)定性有了一定的提高，而酶的活性較原酶而言沒(méi)有下降，有較大的工業(yè)應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案一種來(lái)源于A. oryzae CICC 40186的木聚糖酶基因(AoxynllA)在計(jì)算機(jī)輔助下進(jìn)行理性設(shè)計(jì),得到一種雜合木聚糖酶=AoXynllA1,其完整的DNA和氨基酸序列分別稱(chēng)為SEQID NO 1和SEQ ID NO :2。所述的重組木聚糖酶的活性測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 5. 5、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量濃度為O. 5%的櫸木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C預(yù)熱IOmin,在A管中加入O. ImL 適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)IOmin;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補(bǔ)加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的還原糖 (以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生 I μ mo I還原糖所需的酶量定義為I個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)。所述的耐熱雜合木聚糖酶基因的設(shè)計(jì)、克隆及表達(dá)(I)同源建模模擬AoXynllA的空間結(jié)構(gòu)登錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein data bank (http ://rcsb. org),經(jīng)BLAST比對(duì),找到與AoXynllA具有高度同源序列。本實(shí)驗(yàn)選擇具有非常高的熱穩(wěn)定的EvXynllTS (Protein Data Bank登錄號(hào)為2VUL)為模板，并且兩者的同源性為66. 49%，運(yùn)用SWISS-MODEL服務(wù)器在線(xiàn)全自動(dòng)為AoXynllA構(gòu)建空間結(jié)構(gòu)。運(yùn)用軟件Verify 3D對(duì)同源建模的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估和優(yōu)化，獲得準(zhǔn)確性較高的空間結(jié)構(gòu)模型。(2)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法理性設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定性提高的雜合基因通過(guò)序列比較，我們把EvXynllTS前面5個(gè)氨基酸(NAQTC)添加到AoXynllA的N端，再把雜合酶的32 位T改為C，然后我們以EvXynlIts為模板，對(duì)雜合木聚糖酶進(jìn)行同源建模，再運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法分別對(duì)雜合酶和原酶進(jìn)行總體能量及RMSD值計(jì)算，由結(jié)果我們得出雜合酶的總體能量和RMSD值相對(duì)于原酶而言較小，即熱穩(wěn)定性較好。(3)雜合木聚糖酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法(I)雜合基因AoXynllA1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank上AoXynllA基因序列 (GenBank accessionNo. JQ326257)設(shè)計(jì) 3 個(gè)引物Xynll-F :5，-CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAACTTGTTCCACACCCAGTAGCACGG-3，含有 XhoI 酶切位點(diǎn)Xynll-Rm :5，-GTATGAACCGCCGTTGCCGTTACAGTAAGTCACATCAC-3，Xynll-R :5’ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3’，含有 Not I 酶切位點(diǎn)采用大引物PCR技術(shù)對(duì)原基因進(jìn)行定向誘變，主要分為三步以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶AoxynlIA基因的重組質(zhì)粒(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110410412. 9)為模板，采用引物Xynll-F 和 Xynll-Rm，進(jìn)行 PCR 首輪擴(kuò)增(94 °C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s, 30 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin);對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物核酸電泳并進(jìn)行割膠回收，回收產(chǎn)物作為N端引物，C端引物為 Xynl 1-R，進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 5min ；94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 60s ;72°C延伸 IOmin)； 將第二輪PCR目的條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序；測(cè)序正確的PUCm-T-A0XynllA1與pPIC9KM(已申請(qǐng)專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)201110410391. O)質(zhì)粒均用Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在 T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPICgKM-AoXynllA1,并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；⑵GSlWAoxynllAi重組子的構(gòu)建、表達(dá)及酶活的測(cè)定用Sac I對(duì) PPICgKM-A0XynllA1進(jìn)行線(xiàn)性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GSlM/AoxynllAi ;該工程菌用I. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，對(duì)該酶和原酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較在O. 5%的櫸木木聚糖底物、反應(yīng)時(shí)間為 IOmin的情況下,AoXynllA1的最適溫度由原酶的55°C提高為58°C ;55°C預(yù)熱下,AoXynllA1的半衰期由原酶的 4min升到 28min。本專(zhuān)利技術(shù)對(duì)米曲霉常溫木聚糖酶進(jìn)行了定向改造，在保持原酶活性的基礎(chǔ)上，提高了該酶的熱穩(wěn)定性，使其具有更好的工業(yè)應(yīng)用本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的常溫木聚糖酶基因Aoxyn11A，以另一個(gè)同家族的超耐熱木聚糖酶基因Syxyn11(GenBank?accession?NO.JX459567)模板，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及其相關(guān)軟件，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，對(duì)AoXyn11A分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，定向改造以提高熱穩(wěn)定性。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬于糖苷水解酶第11家族的常溫木聚糖酶基因AoxynllA,以另一個(gè)同家族的超耐熱木聚糖酶基因Syxynll (GenBankaccession NO. JX459567)模板，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)及其相關(guān)軟件，結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法，對(duì)AoXynllA分子進(jìn)行理性設(shè)計(jì),定向改造以提高熱穩(wěn)定性。2.利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法理性設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定性提高的雜合基因 (1)同源建模模擬AoXynllA的空間結(jié)構(gòu)登錄蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Proteindatabank (http ://rcsb. org),經(jīng)BLAST比對(duì),找到與AoXynllA具有高度同源的序列；本實(shí)驗(yàn)選擇熱穩(wěn)定非常高的EvXynlIts (Protein Data Bank登錄號(hào)為2VUL)為模板，并且兩者的同源性為66. 49%，運(yùn)用SWISS-MODEL服務(wù)器在線(xiàn)全自動(dòng)為A. oryzae常溫木聚糖酶成熟肽構(gòu)建空間結(jié)構(gòu)；運(yùn)用軟件Verify_3D對(duì)同源建模的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行評(píng)估和優(yōu)化，獲得準(zhǔn)確性較高的空間結(jié)構(gòu)模型； (2)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法理性設(shè)計(jì)熱穩(wěn)定性提高的雜合基因通過(guò)序列比較，我們把EvXynlIts前面5個(gè)氨基酸(NAQTC)添加到AoXynllA的N端，再把雜合酶的32位T改為C，然后我們以EvXynlIts為模板，對(duì)雜合木聚糖酶進(jìn)行同源建模，再運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法分別對(duì)雜合酶和原酶進(jìn)行總體能量及RMSD值計(jì)算，由結(jié)果我們得出雜合酶的總體能量和RMSD值相對(duì)于原酶而言較小，即熱穩(wěn)定性較好。3.雜合木聚糖酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法 (I)雜合基因AoxynllA1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank上AoxynllA基因序列(GenBank accessionNo. JQ326257)設(shè)計(jì) 3 個(gè)引物Xynll-F :5’ -CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAA...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄔敏辰，陳忠法，胡蝶，李劍芳，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：江南大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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