本發(fā)明專利技術(shù)提供了用于檢測靶標多核苷酸拷貝數(shù)差異的組合物和方法。在一些情況下，當初始樣品是母體組織(例如，血液、血漿)時，此處提供的方法和組合物可用于診斷胎兒遺傳異常。所述方法和材料應(yīng)用的技術(shù)允許檢測多核苷酸拷貝數(shù)雖微小但統(tǒng)計學顯著的差異。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】用于檢測遺傳物質(zhì)的方法和組合物相關(guān)串請的交叉引用本申請根據(jù)美國法典第35篇第119(e)條要求獲得2009年11月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/264，591、2010年3月2日申請的美國臨時申請?zhí)?1/309，837、2010年3月2日申請的美國臨時申請?zhí)?1/309，845,2010年3月25日申請 的美國臨時申請?zhí)?1/317，635,2010年3月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/317，639,2010年3月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/317，684、2010年3月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/341，065、2010年3月25日申請的美國臨時申請?zhí)?1/341，218、2010年9月8日申請的美國臨時申請?zhí)?1/380, 981,2010年11月I日申請的美國臨時申請?zhí)?1/409，106,2010年11月2日申請的美國臨時申請?zhí)?1/409，473、2010年11月5日申請的美國臨時申請?zhí)?1/410，769的利益，其中每個申請都整體援引并入本文。
技術(shù)介紹
胎兒非整倍性是染色體數(shù)的畸變，通常是由于卵子或精子發(fā)生期間的減數(shù)分裂不分離引起的；然而，某些非整倍性如三體性8更通常地是由于合子后有絲分裂分離導致的(Nicolaidis 和 Petersen (1998)Human Reproduction 13:313-319)。這樣的畸變包括正常染色體數(shù)的減少和增加，并且可涉及常染色體以及性染色體。減少性非整倍性的一個例子是特納綜合征，其典型特征是存在單X性染色體。染色體數(shù)增加的例子包括唐氏綜合征(染色體21三體)、帕韜氏綜合征(染色體13三體)、愛德華氏綜合征(染色體18三體)和克氏綜合征(Kleinfelter' s syndrome)(性染色體的XXY三體)。非整倍性通常導致顯著的身體和神經(jīng)損傷，這導致很高百分比的受影響個體不能存活至成年。事實上，除13、18或21之外其它染色體的常染色體非整倍性胎兒通常在子宮內(nèi)死亡。然而，某些非整倍性，如克氏綜合征，表現(xiàn)出的表型非常不明顯，并且那些受其它三體性如XXY和XXX影響者常常發(fā)育成熟為具有生育能力的成年人。在一些情況下，導致染色體一部分的拷貝數(shù)異常的部分非整倍性可能是由于不平衡的不分離引起的。采用侵入性檢測(例如通過羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜絨毛取樣(CVS))對胎兒進行非整倍性的產(chǎn)前診斷，這與O. 5% -2%的流產(chǎn)操作相關(guān)風險有關(guān)(D' Alton, Μ. E.，(1994)Semin Perinatol 18 :140-62 ;Caughey AB (2006)Obstet Gynecol 108:612-6)。準確篩查胎兒非整倍性的另一個障礙在于母親血漿中胎兒DNA濃度較低，尤其是在孕齡較早時。單路或低級多路檢測方法不可能提供足夠的靶標數(shù)來區(qū)分整倍性胎兒和非整倍性胎兒(例如染色體21三體)。通常，本領(lǐng)域還需要用于檢測生物學樣品(不一定來自于母親血液)中拷貝數(shù)變異的方法和組合物。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本公開文本提供了用于檢測遺傳物質(zhì)群體內(nèi)靶標多核苷酸的拷貝數(shù)的方法和組合物。可以利用分配將靶標多核苷酸細分到多個反應(yīng)體積。在一些情況下，針對靶標多核苷酸的探針被細分到多個反應(yīng)體積。在一些情況下，所述方法包括如下步驟a.將第一連接探針與第一靶標多核苷酸結(jié)合；b.將第二連接探針與第二靶標多核苷酸結(jié)合；c.使所述第一和第二連接探針進行連接反應(yīng)以獲得一種或多種連接產(chǎn)物；d.將所述一種或多種連接產(chǎn)物分配到兩個或更多個分區(qū)中；e.擴增所述一種或多種連接產(chǎn)物內(nèi)的序列以獲得擴增產(chǎn)物；f.確定包含所述擴增產(chǎn)物的所述分區(qū)的數(shù)目；以及g.計算所述第一靶標多核苷酸的拷貝數(shù)。在一些情況下，靶標多核苷酸沒有被分配到所述兩個或更多個分區(qū)中。分區(qū)可以包括多種類型的分區(qū)，包括固體分區(qū)(即孔、管等等)和流體分區(qū)(例如油相如連續(xù)油相中的水性小滴或至少兩種不混溶流體的混合物中的水性小滴)。分區(qū)也可以是穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的。例如，在一些情況下，在擴增過程期間，所述兩個或更多個分區(qū)基本上保持完整。在一些情況下，分區(qū)是油相中的水性小滴，且所述水性小滴在本方法的擴增反應(yīng)期間基本保持完整。當評價分區(qū)是否存在一種或多種靶標多核苷酸(或針對所述多核苷酸的探針)時，在確定步驟期間所述分區(qū)(例如所述水性小滴)也可基本上保持完整。所述分區(qū)可能包含從所述連接產(chǎn)物起始的擴增反應(yīng)。 第一和第二連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計為結(jié)合)多種靶標多核苷酸；通常，第一連接探針結(jié)合第一靶標多核苷酸，而第二連接探針結(jié)合第二多核苷酸。在一些情況下，第一和第二連接探針各自被設(shè)計為結(jié)合所述第一靶標多核苷酸。在其它情況下，所述第一連接探針結(jié)合第一靶標多核苷酸，該第一靶標多核苷酸的序列不同于所述第二靶標多核苷酸的序列。在一些情況下，第一連接探針被設(shè)計為結(jié)合在種內(nèi)個體間保守的多核苷酸序列。在一些情況下，第一連接探針被設(shè)計為結(jié)合在兩個或更多不同種間保守的多核苷酸序列。在一些情況下，連接探針結(jié)合染色體的非多態(tài)性區(qū)域。在一些實施方案中，所述方法包括將多條連接探針連接于所述第一靶標多核苷酸。例如，所述方法可包括將至少4條連接探針結(jié)合于所述第一靶標多核苷酸。在其它情況下，此處提供的方法中使用至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20, 000,30, 000,40, 000,50, 000,60, 000,70, 000,100, 000、2，000，000,3, 000，000,4, 000，000,5, 000，000,6, 000，000,7, 000，000,8, 000，000、9，000, 000或10，000，000條連接探針。通常，一條或更多的所述連接探針結(jié)合于不同多核苷酸(例如，不同染色體、相同染色體內(nèi)的不同區(qū)域)。在一些情況下，在本方法和組合物中，使用多個第一連接探針(例如靶標連接探針)，并且使用多個第二連接探針(例如參照連接探針)。該方法可進一步包括將至少4條連接探針結(jié)合于所述第一靶標多核苷酸，并且將至少4條連接探針結(jié)合于所述第二靶標多核苷酸。在一些情況下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20, 000,30, 000、40，000,50, 000,60, 000,70, 000、100，000,2, 000，000,3, 000，000,4, 000，000,5, 000，000、6，000，000,7, 000，000,8, 000，000,9, 000，000 或 10，000，000 條連接探針結(jié)合于所述第一或所述第二靶標多核苷酸。第一連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計為結(jié)合)所述第一靶標多核苷酸中的第一區(qū)域，并且所述第二連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計為結(jié)合)所述第一靶標多核苷酸中的第二區(qū)域，其中所述第一和第二區(qū)域沒有相同序列。第一靶標多核苷酸通常與所述第二靶標多核苷酸不相同。在一些情況下，第一靶標多核苷酸與所述第二靶標多核苷酸相同。在一些例子中，所述第一靶標多核苷酸是測試染色體，而所述第二靶標多核苷酸是參照染本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：本杰明·辛德森，瑟奇·薩克森諾夫，菲利普·貝爾格萊德，凱文·奈斯，邁克爾·盧塞羅，比利·科爾斯頓，
申請(專利權(quán))人：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，
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