本發(fā)明專利技術(shù)提供檢測在體外激活沉默調(diào)節(jié)蛋白脫乙酰基酶對不含熒光基團的活化底物活性的化合物的方法和組合物。還提供式(I)至式(XXI)的沉默調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)化合物以及相關(guān)化合物(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)，包括式(XL)、(XI)、(XII)和(XIII)的不含熒光基團的底物SIRT1活化劑化合物。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】沉默調(diào)節(jié)蛋白活化劑和活化測定
技術(shù)介紹
基因的沉默信息調(diào)節(jié)劑(Silent Information Regulator, SIR)家族代表存在于范圍從古細菌(archaebacteria)至真核生物的生物體的基因組中的高度保守性ー組基因。編碼的SIR蛋白質(zhì)涉及從基因沉默的調(diào)節(jié)至DNA修復的各種不同程序。由SIR基因家族成員編碼的蛋白質(zhì)顯示在250氨基酸核心結(jié)構(gòu)域中有高度序列保守。此家族中已相當特征化的基因為釀酒酵母SIR2(S. cerevisiae SIR2)，其涉及含有指定酵母交配型、端粒位置效應(yīng)及細胞老化的信息的沉默HM基因座。酵母Sir2蛋白質(zhì)屬于組蛋白脫こ酰基酶的家族。于鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中的Sir2同系物，CobB,起到NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)-依賴性ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的作用。Sir2蛋白為使用NAD+作為協(xié)同底物的第III類脫こ?；浮２煌谄渌摛初?基酶，這些中的許多涉及基因沉默，Sir2對第I類及第II類組蛋白脫こ酰基酶抑制劑，例如曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)不具敏感性。通過Sir2進行的こ?；?賴氨酸的脫こ?；?與NAD+水解作用緊密結(jié)合，產(chǎn)生煙酰胺與新的こ酰基-ADP核糖化合物。Sir2的NAD+-依賴性脫こ?；富钚詫τ趯⑵渖飳W作用與酵母中的細胞代謝作用結(jié)合這一功能而言是必需的。哺乳動物Sir2同系物具有NAD+-依賴性組蛋白脫こ酰基酶活性。生物化學的研究已顯示，Sir2可容易地將組蛋白H3與H4的氨基末端尾部脫こ?；?，導致形成1-0-こ?；?ADP-核糖與煙酰胺。具有另外SIR2拷貝的菌株顯示其rDNA沉默增加且壽命增長30%。最近已顯示，秀麗隱桿線蟲(C. elegans) SIR2同系物(sir-2. I)及果蠅(D. melanogaster) dSir2基因的另外拷貝會大大延長這些生物體的壽命。這暗示了，針對老化的SIR2-依賴性調(diào)節(jié)途徑，其在演化早期已出現(xiàn)且已經(jīng)是相當保守的(conserve)?，F(xiàn)今，Sir2基因據(jù)相信已經(jīng)演化以增強生物體的健康與抗應(yīng)激反應(yīng),來增加其逆境存活(surviving adversity)的機會。在人中有7種Sir2-類基因(SIRT1-SI RT7)，它們共享Sir2保守催化結(jié)構(gòu)域。SIRTl為具有與Sir2最高程度序列相似性的核蛋白。SIRTl通過脫こ?；饔谜{(diào)節(jié)多重細胞靶物，包括腫瘤抑制基因P53、細胞信號傳導因子NF-kB和F0X0轉(zhuǎn)錄因子。SIRT3為SIRTl的同系物，其在原核生物與真核生物中具保守性。SIRT3蛋白通過位于N-末端的獨特結(jié)構(gòu)域祀向至線粒體嵴(cristae)。SIRT3具有NAD+-依賴性蛋白質(zhì)脫こ?；富钚?，且被普遍地(upbiquitously)表達在，特別是在代謝活性的組織中。在轉(zhuǎn)移至線粒體時，認為SIRT3被線粒體基質(zhì)加工肽酶(MPP)裂解成更小的活性形式。已知攝熱量限制(caloric restriction)有70年以上，以增進健康并延長哺乳動物的壽命。酵母(如后生動物)的壽命也通過類似攝熱量限制(例如低葡萄糖)的介入來增長。發(fā)現(xiàn)缺乏SIR2基因的酵母與蠅類在經(jīng)攝熱量限制時都不再存活，這為SIR2基因介導此類限制熱量的飲食有益健康功效提供了證據(jù)。而且，降低酵母葡萄糖-響應(yīng)性cAMP(腺苷3’，5’ -單磷酸)-依賴性(PKA)途徑活性的突變，會延長野生型細胞的壽命，但在突變型sir2菌株中則不會延長，這證明SIR2可能是攝熱量限制途徑的關(guān)鍵下游組分。另外，經(jīng)過在小鼠中基因缺失或過度表達的研究(其中進行了 SIRTl蛋白和活性水平的研究)已經(jīng)驗證了在幾種疾病模型中升高的SIRTl活性的有益效果，所述疾病模型包括涉及代謝性應(yīng)激的那些(Haigis,M. C.,和Sinclair, D. (2010) Annu Rev Pathol5,253-259 ；Baur, J. A. (2010) Mech Aging Dev)。最近也在人中觀察到該效果，其中在胰島素-敏感的組織中降低的SIRTl表達與能量消耗的降低有關(guān)(Rutanen等，(2010)Diabetes)。因此，對于許多其中認為SIRTl起作用的疾病，預期治療效果根據(jù)給藥該酶的脫こ?；富钚缘幕罨瘎┑玫?。在過去幾年內(nèi)，已經(jīng)開發(fā)了 SIRTl激活化合物(STAC)，包括白藜蘆醇和更特異的，化學上不同的分子(Milne等，(2007)Nature 450,712-716 ；Bemis 等，(2009) Bioorg Med Chem Lett 19，2350-2353 ;Vu 等，(2009) J. Med. Chem.)。當在這些疾病的基于細胞的和動物模型中測試吋，STAC產(chǎn)生與該酶的直接活化一致的效果(MiIne 等，(2007) Nature 450, 712-716 ;Feige 等，(2008) Cell Metab 8, 347-358 ;Funk 等，J Pharmacol Exp Ther ;Jin 等,(2009)Protein Sci 18，514-525 ;Liu 等,(2008)Nature 456，269-273 ;Smith 等，(2009)BMC Syst Biol 3，31 ;Yamazaki 等，(2009) Am J PhysiolEndocrinol Metab ;Yoshizaki 等，(2009)Mol Cell Biol 29,1363-1374)。在分子水平，關(guān)于這些化合物加速SIRTl-催化的脫こ?；臋C理仍需大量探索。一個感興趣的方面為根據(jù)肽底物的結(jié)構(gòu)特征的活化。該SIRTl活化方面首先發(fā)現(xiàn)于2005，當時兩篇文章報道白藜蘆醇可以激活SIRTl-催化的Ac-Arg-His-Lys-LySAe-AMC的脫こ?；?，但不是該肽的簡單酰胺或酸(見Howitz 等，(2003) Nature 425，19ト 196 ;Borra 等，(2005) J. Biol. Chem. 280, 17187-17195 ；Kaeberlein 等，(2005) J. Biol. Chem. 280，17038-17045)。最近，白藜蘆醇的結(jié)果得以確證(Beher 等,(2009)Chem BiolDrug Des),而且被 Pacholec 等進一步擴展(Pacholec等，(2010) J. Biol. Chem. 285,8340-8351)至包括三種之前報道的 STAC SRT1460, SRT1720和 SRT2183，其最初被 Milne 等((2007) Nature 450,712-716)公開(見圖 I)。Pacholec等((2010)J. Biol. Chem. 285，8340-8351)使用幾種こ?；碾牡孜镅芯苛?SIRTl的STAC-介導的活化，包括Milne等((2007) Nature 450,712-716)使用的TAMRA-標記的20mer (TAMRA-肽；該肽底物和其它肽底物的結(jié)構(gòu)詳見表3)，以及SIRTl的兩種蛋白底物。該研究的主要觀察為(i) TAMRA-標記物的存在對活化是本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴晗，TV里拉，RL斯坦恩，B什切潘凱威茨，
申請(專利權(quán))人：西特里斯藥業(yè)公司，
類型：
國別省市：
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